中藥指紋圖譜的測(cè)定方法(目前,中藥指紋圖譜技術(shù)有哪幾種使用方法)
1.目前,中藥指紋圖譜技術(shù)有哪幾種使用方法
目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。
其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認(rèn)的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)；中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，且積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。
因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC—MS和GC—MS等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，中藥指紋圖譜技術(shù)更趨完善。
2.中藥指紋圖譜的分析、技術(shù)
隨著分離分析技術(shù)的發(fā)展，中藥質(zhì)量研究也由過(guò)去“四大鑒別”（基元鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別）發(fā)展到反映中藥材全貌的指紋體系，即反映中藥材的多元化學(xué)組成特性的化學(xué)指紋圖譜和反映生物體 （除礦物、樹(shù)脂類外） 特性的基因指紋圖譜，從有效成分和遺傳物質(zhì)兩方面實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材的質(zhì)量控制，為中藥材以及中成藥提供綜合的和可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
中國(guó)中藥指紋圖譜的研究已有相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)，最早可以追溯到20世紀(jì)60年代，如采用薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜法來(lái)描述中藥材主要成分的特征，這是早期的原始的指紋圖譜，具有直觀、在簡(jiǎn)單情況下容易比較差異的優(yōu)點(diǎn)。隨著分析技術(shù)的飛速發(fā)展和微電腦的廣泛應(yīng)用，基于化學(xué)計(jì)量法的中藥指紋圖譜的研究方法向高效、靈敏、專屬、智能化、聯(lián)用型的方向發(fā)展，高效液相、高效毛細(xì)管電泳、高速逆流色譜、核磁共振、近紅外光譜等新興分析技術(shù)的應(yīng)用和各種數(shù)學(xué)分析方法的運(yùn)用，為中藥指紋圖譜的研究與發(fā)展提供了廣闊的前景。
紫外光譜指紋圖譜紫外光譜法是1995年以前指紋圖譜常用的方法。由于不同中藥所含的不飽和程度有差異，因而導(dǎo)致其紫外吸收曲線的形態(tài)、峰位、峰強(qiáng)度亦有差異，以此達(dá)到鑒別效果。
常用導(dǎo)數(shù)光譜及結(jié)合各種數(shù)學(xué)分析法來(lái)消除樣品中的一些無(wú)關(guān)吸收，排除原圖譜中的某些干擾。紅外光譜（IR ）指紋圖譜紅外光譜又稱分子振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，是一種分子吸收光譜。
當(dāng)樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí)，分子吸收了某些頻率的輻射，并由其振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)引起偶極矩的凈變化，產(chǎn)生分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷，使相應(yīng)于這些吸收區(qū)域的透射光強(qiáng)度減弱。記錄紅外光的百分透射與波數(shù)或波長(zhǎng)關(guān)系的曲線，就得到紅外光譜。
一般的紅外光譜是對(duì)整個(gè)化合物分子的鑒別，比單純的官能團(tuán)的化學(xué)定性鑒別專一性更強(qiáng)。而中藥材的紅外光譜在本質(zhì)上與純化合物紅外光譜不同，它是混合物中各個(gè)組分紅外光譜的疊加。
中藥材各種化學(xué)成分只要在質(zhì)和量的方面相對(duì)穩(wěn)定，并且樣品處理方法按同一要求進(jìn)行，則其紅外光譜也是應(yīng)該相對(duì)穩(wěn)定的。因此這樣得到的混合物紅外光譜應(yīng)該是具有一定的客觀性和可重復(fù)性。
利用上述原理，不同混合物的紅外光譜各主要吸收峰歸屬，只要在4000-400cm，范圍內(nèi)比較光譜差異即可。這種差異可以表現(xiàn)在三個(gè)方面：一是在某一波數(shù)處鑒別雙方只有一方有明顯差異；二是在某一波數(shù)內(nèi)，鑒別雙方的光譜中，吸收峰的形狀和強(qiáng)度都有明顯差異；三是“指紋區(qū)”，面貌不同。
近紅外光譜法近紅外光譜法（NIRS）是一種用于鑒定有機(jī)物質(zhì)十分有用的技術(shù)，是中紅外光譜中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長(zhǎng)范圍為780nm-2500nm，而且該光譜取決于粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素。
因此待測(cè)物光譜的鑒定不可能直接與參比物質(zhì)光譜比較后確定，需要通過(guò)一系列樣本的檢測(cè)（必須預(yù)先知道樣本中相關(guān)成分的含量或樣本的定性歸屬），運(yùn)用化學(xué)計(jì)算學(xué)手段，建立樣本與信息之間的數(shù)學(xué)模型。運(yùn)用該模型即可以對(duì)未知樣本（例如新近購(gòu)進(jìn)的原藥材或新生產(chǎn)的成品等）進(jìn)行辨別分析（給出結(jié)果：合格與否、含量多少等）。
該方法為非破壞性方法，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的無(wú)損檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，所需樣品少，適宜于液體、固體、粘稠流體的分析及過(guò)程控制等優(yōu)點(diǎn)。但是在進(jìn)行定性定量分析中必須采用一定的數(shù)據(jù)處理，需要掌握一定的化學(xué)計(jì)量知識(shí)。
熒光光譜中藥注射劑常含熒光性物質(zhì)，但因不同注射劑所含具體熒光性物質(zhì)不同，同種注射劑又因廠家的具體配方的差異或制備工藝條件的波動(dòng)，均會(huì)使其特征的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜不同或其強(qiáng)度呈現(xiàn)差異；根據(jù)注射劑的熒光圖譜的差異達(dá)到快速鑒別、認(rèn)定和控制配方、工藝的目的。熒光光譜不像紅外光譜那樣具有明顯的指紋特征，但具有高靈敏度的顯著優(yōu)勢(shì)，且差異更為一目了然，易于判斷，因此，可以作為紅外光譜指紋技術(shù)的一種補(bǔ)充，用于中藥注射液的鑒別和認(rèn)定，以及生產(chǎn)工藝的控制和成藥熱穩(wěn)定性研究等。
色譜指紋圖譜最實(shí)用、應(yīng)用也是最廣泛。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當(dāng)前符合中藥特色的評(píng)價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式之一。
色譜指紋圖譜最大的優(yōu)點(diǎn)是具有分離的功能。薄層色譜（TLC）指紋圖譜TLC為傳統(tǒng)的定性、半定量分析方法，在中國(guó)“七五”、十一五”及“九五”公關(guān)課題中有大量采用薄層色譜法進(jìn)行地道藥材的定性鑒別。
該法操作簡(jiǎn)單、分析速度快速、一次分析樣品多，提供信息量大，用固定波長(zhǎng)對(duì)薄層展開(kāi)的各個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，所得掃描圖譜比目測(cè)的層析圖譜更加客觀準(zhǔn)確，因此具有較好的指紋鑒別意義。其最大的缺點(diǎn)是重現(xiàn)性以及精密度差，所以在指紋圖譜應(yīng)用中受到限制，但可以作為中藥指紋圖譜研究的借鑒和補(bǔ)充。
氣相色譜（GC）指紋圖譜中藥指紋圖譜技術(shù)GC最適合于各種主含易揮發(fā)性成分藥材及其制劑的分析，尤其是毛細(xì)管氣相色譜法，分辨率很高，往往一個(gè)色譜可以分出百個(gè)成分。該法靈敏度高、分離度好，分析速度快，但是分析范圍只是局限于低沸點(diǎn)成分，是指紋圖譜研。
3.中藥指紋圖譜的分析、技術(shù)
隨著分離分析技術(shù)的發(fā)展，中藥質(zhì)量研究也由過(guò)去“四大鑒別”（基元鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別）發(fā)展到反映中藥材全貌的指紋體系，即反映中藥材的多元化學(xué)組成特性的化學(xué)指紋圖譜和反映生物體 （除礦物、樹(shù)脂類外） 特性的基因指紋圖譜，從有效成分和遺傳物質(zhì)兩方面實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材的質(zhì)量控制，為中藥材以及中成藥提供綜合的和可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
中國(guó)中藥指紋圖譜的研究已有相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)，最早可以追溯到20世紀(jì)60年代，如采用薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜法來(lái)描述中藥材主要成分的特征，這是早期的原始的指紋圖譜，具有直觀、在簡(jiǎn)單情況下容易比較差異的優(yōu)點(diǎn)。隨著分析技術(shù)的飛速發(fā)展和微電腦的廣泛應(yīng)用，基于化學(xué)計(jì)量法的中藥指紋圖譜的研究方法向高效、靈敏、專屬、智能化、聯(lián)用型的方向發(fā)展，高效液相、高效毛細(xì)管電泳、高速逆流色譜、核磁共振、近紅外光譜等新興分析技術(shù)的應(yīng)用和各種數(shù)學(xué)分析方法的運(yùn)用，為中藥指紋圖譜的研究與發(fā)展提供了廣闊的前景。
紫外光譜指紋圖譜紫外光譜法是1995年以前指紋圖譜常用的方法。由于不同中藥所含的不飽和程度有差異，因而導(dǎo)致其紫外吸收曲線的形態(tài)、峰位、峰強(qiáng)度亦有差異，以此達(dá)到鑒別效果。
常用導(dǎo)數(shù)光譜及結(jié)合各種數(shù)學(xué)分析法來(lái)消除樣品中的一些無(wú)關(guān)吸收，排除原圖譜中的某些干擾。紅外光譜（IR ）指紋圖譜紅外光譜又稱分子振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，是一種分子吸收光譜。
當(dāng)樣品受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí)，分子吸收了某些頻率的輻射，并由其振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)引起偶極矩的凈變化，產(chǎn)生分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷，使相應(yīng)于這些吸收區(qū)域的透射光強(qiáng)度減弱。記錄紅外光的百分透射與波數(shù)或波長(zhǎng)關(guān)系的曲線，就得到紅外光譜。
一般的紅外光譜是對(duì)整個(gè)化合物分子的鑒別，比單純的官能團(tuán)的化學(xué)定性鑒別專一性更強(qiáng)。而中藥材的紅外光譜在本質(zhì)上與純化合物紅外光譜不同，它是混合物中各個(gè)組分紅外光譜的疊加。
中藥材各種化學(xué)成分只要在質(zhì)和量的方面相對(duì)穩(wěn)定，并且樣品處理方法按同一要求進(jìn)行，則其紅外光譜也是應(yīng)該相對(duì)穩(wěn)定的。因此這樣得到的混合物紅外光譜應(yīng)該是具有一定的客觀性和可重復(fù)性。
利用上述原理，不同混合物的紅外光譜各主要吸收峰歸屬，只要在4000-400cm，范圍內(nèi)比較光譜差異即可。這種差異可以表現(xiàn)在三個(gè)方面：一是在某一波數(shù)處鑒別雙方只有一方有明顯差異；二是在某一波數(shù)內(nèi)，鑒別雙方的光譜中，吸收峰的形狀和強(qiáng)度都有明顯差異；三是“指紋區(qū)”，面貌不同。
近紅外光譜法近紅外光譜法（NIRS）是一種用于鑒定有機(jī)物質(zhì)十分有用的技術(shù)，是中紅外光譜中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長(zhǎng)范圍為780nm-2500nm，而且該光譜取決于粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素。
因此待測(cè)物光譜的鑒定不可能直接與參比物質(zhì)光譜比較后確定，需要通過(guò)一系列樣本的檢測(cè)（必須預(yù)先知道樣本中相關(guān)成分的含量或樣本的定性歸屬），運(yùn)用化學(xué)計(jì)算學(xué)手段，建立樣本與信息之間的數(shù)學(xué)模型。運(yùn)用該模型即可以對(duì)未知樣本（例如新近購(gòu)進(jìn)的原藥材或新生產(chǎn)的成品等）進(jìn)行辨別分析（給出結(jié)果：合格與否、含量多少等）。
該方法為非破壞性方法，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的無(wú)損檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，所需樣品少，適宜于液體、固體、粘稠流體的分析及過(guò)程控制等優(yōu)點(diǎn)。但是在進(jìn)行定性定量分析中必須采用一定的數(shù)據(jù)處理，需要掌握一定的化學(xué)計(jì)量知識(shí)。
熒光光譜中藥注射劑常含熒光性物質(zhì)，但因不同注射劑所含具體熒光性物質(zhì)不同，同種注射劑又因廠家的具體配方的差異或制備工藝條件的波動(dòng)，均會(huì)使其特征的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜不同或其強(qiáng)度呈現(xiàn)差異；根據(jù)注射劑的熒光圖譜的差異達(dá)到快速鑒別、認(rèn)定和控制配方、工藝的目的。熒光光譜不像紅外光譜那樣具有明顯的指紋特征，但具有高靈敏度的顯著優(yōu)勢(shì)，且差異更為一目了然，易于判斷，因此，可以作為紅外光譜指紋技術(shù)的一種補(bǔ)充，用于中藥注射液的鑒別和認(rèn)定，以及生產(chǎn)工藝的控制和成藥熱穩(wěn)定性研究等。
色譜指紋圖譜最實(shí)用、應(yīng)用也是最廣泛。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當(dāng)前符合中藥特色的評(píng)價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式之一。
色譜指紋圖譜最大的優(yōu)點(diǎn)是具有分離的功能。薄層色譜（TLC）指紋圖譜TLC為傳統(tǒng)的定性、半定量分析方法，在中國(guó)“七五”、十一五”及“九五”公關(guān)課題中有大量采用薄層色譜法進(jìn)行地道藥材的定性鑒別。
該法操作簡(jiǎn)單、分析速度快速、一次分析樣品多，提供信息量大，用固定波長(zhǎng)對(duì)薄層展開(kāi)的各個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，所得掃描圖譜比目測(cè)的層析圖譜更加客觀準(zhǔn)確，因此具有較好的指紋鑒別意義。其最大的缺點(diǎn)是重現(xiàn)性以及精密度差，所以在指紋圖譜應(yīng)用中受到限制，但可以作為中藥指紋圖譜研究的借鑒和補(bǔ)充。
氣相色譜（GC）指紋圖譜中藥指紋圖譜技術(shù)GC最適合于各種主含易揮發(fā)性成分藥材及其制劑的分析，尤其是毛細(xì)管氣相色譜法，分辨率很高，往往一個(gè)色譜可以分出百個(gè)成分。該法靈敏度高、分離度好，分析速度快，但是分析范圍只是局限于低沸點(diǎn)成分，是指紋圖譜研。
4.中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法
目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。
其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認(rèn)的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)；中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，且積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。
因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC— MS和GC—MS等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，中藥指紋圖譜技術(shù)更趨完善。
1 薄層色譜法（TLC） 薄層色譜具有選用范圍廣，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，常用于中藥各種成分的鑒別。用固定波長(zhǎng)對(duì)薄層展開(kāi)的各斑點(diǎn)作薄層掃描圖譜比目測(cè)的層析圖譜更為客觀準(zhǔn)確，因而具有更好的指紋鑒別意義。
但由于受薄層板的質(zhì)量和開(kāi)放式層析系統(tǒng)等外界因素的影響，易引起一定的實(shí)驗(yàn)誤差。2 氣相色譜法 （GC） 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，適合于藥材及制劑中揮發(fā)性成分指紋圖譜的研究。
一般使用質(zhì)量型檢測(cè)器-氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）。錢浩泉等[5]用氣相色譜法建立了高良姜及其邊緣植物揮發(fā)油成分的指紋圖譜。
具體應(yīng)用中多與質(zhì)譜聯(lián)用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼?zhèn)淞速|(zhì)譜鑒定的高靈敏度和準(zhǔn)確性。3 高效液相色譜法 （HPLC） 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測(cè)器種類多，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，比氣相色譜法應(yīng)用范圍更廣，樣品中大多數(shù)成分均可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，是構(gòu)建指紋圖譜的主要方法之一。由于中藥成分的復(fù)雜性，構(gòu)建指紋圖譜一般采用梯度洗脫，因?yàn)橹鸩教岣吡鲃?dòng)相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。
在考察條件時(shí)，要對(duì)指標(biāo)成分和非指標(biāo)成分都予以考慮，由于藥材中各種成分的吸收波長(zhǎng)及對(duì)不同檢測(cè)器的響應(yīng)不同，在構(gòu)建指紋圖譜時(shí)也需要加以考慮。實(shí)際應(yīng)用中多使用多種聯(lián)用技術(shù)，充分利用各檢測(cè)器的互補(bǔ)性，從不同角度反映藥材及制劑的全貌，從各種圖譜中得到結(jié)構(gòu)信息。
4 高速逆流色譜法 （HSCCC） 它是目前國(guó)際上較新型的液-液分配色譜技術(shù)，利用相對(duì)移動(dòng)的兩種互不相溶溶劑，在處于動(dòng)態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報(bào)道[6]將 HSCCC應(yīng)用于生物堿、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產(chǎn)物的分離分析。
具有分離效率高，溶劑用量少，無(wú)吸附，樣品回收率高，重現(xiàn)性好和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。5 高效毛細(xì)管電泳法 （HPCE） 高效毛細(xì)管電泳技術(shù)是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)，毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)高效快速分離的新型電泳技術(shù)。
毛細(xì)管電泳的廣泛應(yīng)用取決于其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學(xué)中所有的分離對(duì)象，小到無(wú)機(jī)離子，大到蛋白質(zhì)和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質(zhì)[7]。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強(qiáng)、可直接分析水溶液等優(yōu)點(diǎn)。
其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳 （CZE） 和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳色譜 （MECC） 是中草藥分析中最常見(jiàn)的兩種模式。但該方法的重現(xiàn)性有待提高。
6 紫外可見(jiàn)光譜 （UV） 紫外可見(jiàn)光譜反映不同化學(xué)物質(zhì)的電子共扼體系特征，具有加和性，對(duì)于混合物的鑒別專屬性差，分辨率低，故紫外光譜很少用于指紋圖譜的構(gòu)建。7 紅外光譜和近紅外光譜 （IR） 紅外光譜是由分子的振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷產(chǎn)生的光譜，紅外光譜具有高度的特征性。
近紅外光譜法在中藥質(zhì)量控制方面有較好的應(yīng)用前景。8 核磁共振法 （NMR） 從純有機(jī)化合物的核磁共振氫譜上可獲得結(jié)構(gòu)信息，包括各類質(zhì)子的化學(xué)位移、數(shù)量核偶合關(guān)系。
核磁共振譜具有高度的重現(xiàn)性和特征性，易于解析和進(jìn)一步研究，可評(píng)價(jià)藥材和中成藥質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。9 質(zhì)譜法 （MS） 將中藥提取液置質(zhì)譜儀中進(jìn)行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學(xué)成分的質(zhì)譜指紋譜，不同中藥提取液所含成分不同，所得質(zhì)譜圖顯示的分子離子峰及進(jìn)一步，裂解碎片峰不一致，可供鑒別。
10 X射線衍射法 物質(zhì)被X射線照射可產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象，只要某一混合物的組成是恒定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特征圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強(qiáng)，信息量大，所需樣品量小等諸多優(yōu)點(diǎn)，X射線衍射法在動(dòng)物類藥材鑒定與辨別中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。
11 分子生物學(xué)法 （DNA） 利用聚合酶鏈反應(yīng)從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數(shù)目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是最常用的構(gòu)建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用受到限制。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA(RAPD)標(biāo)記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測(cè)DNA的多態(tài)性，這是構(gòu)建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的應(yīng)用前景。
羅志勇等[9]采用 RFLP技術(shù)，分析了人參、西洋參基因 DNA。
5.中藥指紋圖譜的分類
狹義的中藥指紋圖譜是指中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜，廣義的中藥指紋圖譜則可按應(yīng)用對(duì)象、測(cè)定手段進(jìn)行不同的分類。 中藥指紋圖譜按測(cè)定手段可分為中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥生物指紋圖譜主要是測(cè)定各種中藥材的DNA圖譜，由于每個(gè)物種基因的唯一性和遺傳性，中藥材DNA指紋圖譜可用于對(duì)中藥材的種屬鑒定、植物分類研究和品質(zhì)研究。它對(duì)中藥材GAP基地建設(shè)、中藥材種植規(guī)范（SOP）、選擇優(yōu)良種質(zhì)資源和藥材道地性研究極為有用。
中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜是指測(cè)定中藥材所含各種化學(xué)成分（次生代謝產(chǎn)物）而建立的指紋圖譜。雖然化學(xué)成分是次生代謝產(chǎn)物，受生物環(huán)境和生長(zhǎng)年限的影響而產(chǎn)生個(gè)體間較為明顯的差異，但植物的代謝具有遺傳性，作為同一物種的個(gè)體在化學(xué)成分上也具有相似性（similarity），可以用化學(xué)成分的譜圖來(lái)建立指紋圖譜。中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜主要有光譜法和色譜法：如紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振譜（NMR），薄層色譜（TLC）、氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE），以及各種聯(lián)用技術(shù)。中藥材化學(xué)指紋圖譜對(duì)控制中藥材質(zhì)量具有更直接、更重要的意義。
6.中藥指紋圖譜的技術(shù)應(yīng)用
當(dāng)前，中藥指紋圖譜技術(shù)在世界已成為一種發(fā)展趨勢(shì)。首先是美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）允許草藥保健品申報(bào)資料可以提供色譜指紋圖。世界衛(wèi)生組織（WHO）在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中也規(guī)定：如果草藥的活性成份不明，可以提供色譜指紋圖譜以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。歐共體也將色譜指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制。中國(guó)專業(yè)技術(shù)人員對(duì)中藥指紋圖譜進(jìn)行了較早的研究。例如廣州市藥品檢驗(yàn)所、北京大學(xué)、沈陽(yáng)藥科大學(xué)、陜西師范大學(xué)、陜西中醫(yī)藥研究院等科研單位均已從不同角度、不同層面對(duì)中藥指紋圖譜技術(shù)作了深入研究，有些技術(shù)已在實(shí)踐中得到了應(yīng)用。
中藥指紋圖譜技術(shù)是符合中醫(yī)理論及現(xiàn)狀的較好的質(zhì)量控制技術(shù)。因?yàn)樗⒉恍枰敿?xì)了解藥物的具體活性成份信息，只需要了解個(gè)別指標(biāo)性活性組分信息，以指標(biāo)性成份峰作為標(biāo)記，結(jié)合非指標(biāo)成份進(jìn)行比對(duì)，用來(lái)綜合評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，既符合中醫(yī)藥理論的整體觀點(diǎn)，也滿足了對(duì)中藥質(zhì)量的可控、保證其療效的要求。
運(yùn)用中藥指紋圖譜和指標(biāo)成份定量相結(jié)合的方式，既可以完善表述中藥的整體性特征，又別于西藥單一成份定量的質(zhì)量控制模式，要根據(jù)中國(guó)的國(guó)情，建立自己的中藥質(zhì)量控制體系，評(píng)價(jià)體系，盡快建立一支高水準(zhǔn)、高素質(zhì)的科研院所和專業(yè)技術(shù)隊(duì)伍，使中藥指紋圖譜技術(shù)得以推廣和應(yīng)用。
中藥指紋圖譜是用多學(xué)科交叉、綜合技術(shù)手段對(duì)復(fù)雜物質(zhì)組成體系，質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法。又是分析科學(xué)、中藥學(xué)、分離科學(xué)以及化學(xué)、生物信息學(xué)等二級(jí)學(xué)科交叉，綜合應(yīng)用研究的結(jié)果，是中藥現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心技術(shù)之一，又是解決藥品質(zhì)量控制和監(jiān)督這一關(guān)鍵問(wèn)題而采取的一種方法。通過(guò)相似性和相關(guān)性比對(duì)，發(fā)展質(zhì)量變異和缺陷，從而全面特異地把握住中藥的質(zhì)量命脈。又為中藥新藥研發(fā)帶來(lái)了一種嶄新的研究模式，從整體綜合的角度把握住了藥物多靶點(diǎn)作用及針對(duì)性，為新藥發(fā)現(xiàn)和快速篩選提供了思路和方法。
中藥指紋圖譜技術(shù)主要體現(xiàn)了信息獲取、信息處理、信息挖掘三方面的內(nèi)容。具體的講，就是從中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的角度出發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代分離分析科學(xué)的手段，獲取中藥化學(xué)指紋圖譜。結(jié)合藥效研究和相關(guān)物質(zhì)成份的分離鑒定，經(jīng)效譜關(guān)系研究，獲取中藥藥效組分指紋圖譜，并將已取得的指紋圖譜用于中藥材，中間體和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制，以及創(chuàng)新藥物研究的實(shí)踐中，最終解決中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的科學(xué)性和關(guān)鍵問(wèn)題；解決制約中藥發(fā)展，走向國(guó)際市場(chǎng)的瓶頸問(wèn)題。
中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)又與GAP基地建設(shè)，SOP質(zhì)量管理息息相關(guān)。中藥生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化是中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而中藥指紋圖譜技術(shù)又是中藥現(xiàn)代化建設(shè)的主要技術(shù)手段之一，對(duì)中藥“安全、有效和質(zhì)量可控”，保證物種的延續(xù)，遺傳基因的穩(wěn)定性，品種的地道性和藥用價(jià)值起著至關(guān)重要的作用。
