病毒分離與鑒定方法(病毒鑒定常用方法)

1.病毒鑒定常用方法有哪些

寨卡病毒病的檢測(cè)方法包括病毒核酸檢測(cè)、IgM抗體檢測(cè)、中和抗體檢測(cè)和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前主要采用病毒核酸檢測(cè)。

開展蚊媒寨卡病毒檢測(cè)時(shí)，對(duì)捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

開展寨卡病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)考慮登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)按照相應(yīng)的技術(shù)指南開展。

（一）臨床標(biāo)本檢測(cè)。

1.病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢測(cè)主要適用于急性期血液標(biāo)本，一般認(rèn)為發(fā)病7天內(nèi)檢測(cè)陽(yáng)性率高。

(1)核酸檢測(cè)：采用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測(cè)手段。

(2)病毒分離：將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞（C6/36）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內(nèi)接種進(jìn)行病毒分離。

2.血清學(xué)檢測(cè)

(1)血清特異性IgM抗體：發(fā)病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體，但發(fā)病7天后檢出率高?？刹捎肊LISA、免疫熒光等方法檢測(cè)。IgM抗體陽(yáng)性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，易于產(chǎn)生假陽(yáng)性。

(2)中和抗體：采用空斑減少中和試驗(yàn)方法檢測(cè)?；颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。

（二）媒介標(biāo)本檢測(cè)。

1.標(biāo)本處理

將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲，按照采集地點(diǎn)，每10~20只為一份進(jìn)行研磨處理。

2.病毒核酸檢測(cè)

用RT-PCR的方法進(jìn)行寨卡病毒核酸檢測(cè)

3.病毒分離

病毒核酸陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。

2.病毒鑒定常用方法有哪些

寨卡病毒病的檢測(cè)方法包括病毒核酸檢測(cè)、IgM抗體檢測(cè)、中和抗體檢測(cè)和病毒分離等。

寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，目前主要采用病毒核酸檢測(cè)。開展蚊媒寨卡病毒檢測(cè)時(shí)，對(duì)捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

開展寨卡病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同時(shí)考慮登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)按照相應(yīng)的技術(shù)指南開展。

（一）臨床標(biāo)本檢測(cè)。1.病原學(xué)檢測(cè)病原學(xué)檢測(cè)主要適用于急性期血液標(biāo)本，一般認(rèn)為發(fā)病7天內(nèi)檢測(cè)陽(yáng)性率高。

（1）核酸檢測(cè)：采用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測(cè)手段。（2）病毒分離：將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞（C6/36）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)核酸的方法鑒定病毒。

也可使用乳鼠腦內(nèi)接種進(jìn)行病毒分離。2.血清學(xué)檢測(cè)（1）血清特異性IgM抗體：發(fā)病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體，但發(fā)病7天后檢出率高。

可采用ELISA、免疫熒光等方法檢測(cè)。IgM抗體陽(yáng)性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，易于產(chǎn)生假陽(yáng)性。

（2）中和抗體：采用空斑減少中和試驗(yàn)方法檢測(cè)。患者恢復(fù)期血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。

（二）媒介標(biāo)本檢測(cè)。1.標(biāo)本處理將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲，按照采集地點(diǎn)，每10~20只為一份進(jìn)行研磨處理。

2.病毒核酸檢測(cè)用RT-PCR的方法進(jìn)行寨卡病毒核酸檢測(cè)3.病毒分離病毒核酸陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。

3.和病毒常用的分離培養(yǎng)方法有哪些區(qū)別

病毒的培養(yǎng)方法有動(dòng)物接種、雞胚培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)。

1、動(dòng)物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進(jìn)入易感動(dòng)物的體內(nèi)后可大量增殖，并使動(dòng)物產(chǎn)生特定的反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：操作方面易行。缺點(diǎn)：受機(jī)體免疫力的影響，常需要用無(wú)菌動(dòng)物。疫苗和抗血清的生產(chǎn)。

2、雞胚培養(yǎng)：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內(nèi)，羊膜腔，尿囊腔等部位。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。

3、組織培養(yǎng)：在離體活細(xì)胞上培養(yǎng)病毒的方法，組織塊培養(yǎng)：取組織片進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)：病毒感染細(xì)胞后，大多數(shù)引起細(xì)胞病變，稱為病毒的致細(xì)胞病變作用。表現(xiàn)為細(xì)胞變形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆?；?，核濃縮、核裂解等。

4、采用該病毒所寄生的細(xì)胞的全素培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)該細(xì)胞，培養(yǎng)一段時(shí)間后放進(jìn)特定的病毒就可以培養(yǎng)了，注意，若細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基要加入血清。

4.分離病毒的鑒定是怎樣的

1.病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征 （1）細(xì)胞致病作用（Cytopathogeniceffect,CPE）病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞退形性變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。

某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測(cè)性診斷（表23-4）。 免疫熒光（IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

表23-4 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征病毒增殖指征CPE病毒小RNA病毒單純皰疹病毒腺病毒副粘病毒HIV非CPE病毒正粘病毒副粘病毒風(fēng)疹病毒鼻病毒細(xì)胞園縮、單層破壞細(xì)胞腫大變園細(xì)胞變園堆積成葡萄狀多核巨細(xì)胞（合胞體）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象干擾并阻止其他病毒（如ECHO病毒）的細(xì)胞致病作用 （2）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（） 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時(shí)，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。 若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。

這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。 （3）干擾現(xiàn)象（Interference phenomenon）一種病毒感染細(xì)胞后可以干擾另一種病毒在該細(xì)胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。

前者為不產(chǎn)生CPE的病毒（如風(fēng)疹病毒）但能干擾以后進(jìn)入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。 2.病毒感染性的定量測(cè)定 空斑形成單位 （Plaque-forming unit ,PFU）測(cè)定這是一種測(cè)定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。

將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長(zhǎng)單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個(gè)感染性病毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒(méi)有著色的“空斑”，清楚可見。

由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位（PFU）來(lái)表示。 （2）50%致死量（LD50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）的測(cè)定本法可估計(jì)所含病毒的感染量。

方法是測(cè)定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50%感染量或50%組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。 3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。

還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。 4.血清學(xué)鑒定用已知的診斷血清來(lái)鑒定。

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可鑒定病毒科屬；中和試驗(yàn)或血凝搗蛋制試驗(yàn)可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來(lái)源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗(yàn)，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。

以上是我對(duì)于這個(gè)問(wèn)題的解答，希望能夠幫到大家。

5.鱉病的病毒性病原的分離與鑒定有哪些方法

分離病毒的方法很多，這里介紹一種比較簡(jiǎn)單的方法。

①解剖病鱉，取肝、脾、腎等內(nèi)臟器官，用滅菌生理鹽水洗2-3次后，剪碎，勻槳機(jī)勻漿，含800-1000國(guó)際單位/毫升青霉素、鏈霉素的Hank's液，制成10%-20%的組織懸液，再以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘；取上清液，使其通過(guò)0.2微米的細(xì)菌濾器除菌。 ②取濾液接種健康鱉，觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)與自然發(fā)病相似的癥狀。

若出現(xiàn)相似癥狀，可證明該鱉病為病毒性疾病。但要鑒定為何種病毒，需要繼續(xù)進(jìn)行電鏡觀察和特定的生理生化實(shí)驗(yàn)，確定其核酸類型和生物學(xué)特征。

③對(duì)常見病毒可進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、PCR鑒定或免疫學(xué)鑒定等。

6.目前病毒分離培養(yǎng)的主要方法是哪一種

1.動(dòng)物接種

這是最原始的病毒培養(yǎng)方法。常用的動(dòng)物有小鼠、大鼠、豚鼠百、兔和猴等，接種的途徑有鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腦內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈等。根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位。

2.雞胚接種雞胚對(duì)多種病度毒敏感。根據(jù)病毒種類不同，可將標(biāo)本接種于雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜上。

3.組織培養(yǎng)

將離體活組織塊或分散的活細(xì)胞加回以培養(yǎng)，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)法有三種基本類型：器官培養(yǎng)、移植培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)最常答用于培養(yǎng)病毒，根據(jù)細(xì)胞的來(lái)源，染色體特性及傳代次數(shù)又可分為下列類型：原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)，二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系。

7.流感病毒如何分離鑒定

流感患者標(biāo)本的采集與處理

1. 發(fā)病三日內(nèi)的急性期患者，用15ml肉湯或Hanks液反復(fù)嗽口或咽嗽2~3分鐘，然后吐入試管中，亦可經(jīng)裝有二層紗布的無(wú)菌小漏斗過(guò)濾入試管中。

2. 將咽嗽液置于4℃冰箱中約20分鐘，待顆粒物質(zhì)充分沉淀后，吸上清液約2-5ml置另一無(wú)菌試管，加入抗菌素，使每毫升標(biāo)本中含青霉素1000單位、鏈霉素1000微克。

3. 混勻后置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?4小時(shí)內(nèi)使用。

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