制作平板培養(yǎng)基的(配制培養(yǎng)基應注意哪些問題)
1.配制培養(yǎng)基應注意哪些問題
1、培養(yǎng)基配方的選定
同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規(guī)定進行配制外，一般均應盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。
2、培養(yǎng)基的制備記錄
每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，復制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。
3、培養(yǎng)基成分的稱取
培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側(cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。
4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化
培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。
5、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正
因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。
6、培養(yǎng)基的過濾澄清
液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。
瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。
7、培養(yǎng)基的分裝
培養(yǎng)基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。
8、培養(yǎng)基的滅菌
一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。
某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。
瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。
9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試
每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。
將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。
用有關(guān)的標準菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。
10、培養(yǎng)基的保存
培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽。
2.培養(yǎng)基的制作及無菌操作技術(shù)常見的注意事項
培養(yǎng)基的制作注意事項：
1 注意營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比和C/N比
2 控制pH條件
3 原料來源的選擇
4 滅菌處理
無菌操作注意事項：
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每
次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間
污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間
隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操
作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒
感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少Class II）。操作過程
中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。
5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)（300
小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水
3.配置培養(yǎng)基的基本步驟有哪些
培養(yǎng)基的配置應該注意的幾大步驟：1、常用玻璃儀器的準備制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。
（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。 （2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。
（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應按上法處理，也應裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用。
2、培養(yǎng)基的制備及儲存 （1）溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補足水分。
在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞。 （2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當?shù)膒H。
因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。
當調(diào)節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。
因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調(diào)節(jié)。干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時也必須再驗證。
測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。
（ 更多質(zhì)量檢測、分析測試、化學計量、標準物質(zhì)相關(guān)技術(shù)資料請參考中國標準物質(zhì) ） (3)培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準和確認。每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管。
固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。 平皿：傾注平皿，應在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min。
讓水蒸汽自然蒸發(fā)。 斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應用布抹去，以避免污染。
高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用。 分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當天（2h內(nèi)最佳）進行滅菌處理。
液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定。
普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應延長至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。
含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌。
高壓滅菌應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物。以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。
通過無菌技術(shù)為測試制備的每一批培養(yǎng)基其PH在放冷至室溫（25°）后，都應測定。一個扁平的pH計用于培養(yǎng)基表面pH值的測定，浸入式的pH計用于液體的測定。
各供應商提供的培養(yǎng)基的pH應該在規(guī)定的±0.2的范圍內(nèi)，除非通過驗證得到更寬的范圍 注意：按配方計算培養(yǎng)基中各種成分的用量→稱量，（一般動作要迅速一些，因為其中可能有些成分容易吸潮）→溶化（將稱好的各種成分溶解在水中，如果是固體培養(yǎng)基，需要使用凝固劑，如瓊脂等，熔化時，注意攪拌，防止糊底）→調(diào)pH→滅菌（高壓蒸汽滅菌）→倒平板 1）確認培養(yǎng)基的成分，并精確稱量；2）加入各個成分的順序；3）準確調(diào)pH;4） 適當?shù)臏缇椒ǎ?）無菌條件下分裝.。
