pcr引物設計(PCR引物設計時有哪些注意事項)

1.PCR引物設計時有哪些注意事項

引物設計參數(shù)：

a

引物長度一般在20bp左右，上下游引物堿基長度不要相差超過4個堿基。

b

引物退火溫度一般在58度，不同軟件TM使用不同的算法，primer3,primer

5,primer

6,primer

express等一般可以設置在55-58度，beacon

design可以設置在65左右。

c

GC含量一般沒什么特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。

d

產(chǎn)物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區(qū)分，超過200bp可能會影響PCR擴增效率。

e

軟件給出的引物不能有發(fā)卡結構和超過3-4個堿基的匹配，特別是3`端不能有堿基匹配，那樣更容易形成二聚體。

f

引物設計好以后，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

2.PCR引物設計應該注意的問題?

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

3.PCR引物設計應遵循哪些原則

1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp;2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3'的下降形狀也有利于引物與模板的結合；4、ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利于正確引發(fā)反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%,-8時少于20%,-10時接近于0;5、錯配率一般不要超過100，否則會出現(xiàn)非目的條帶。

但對于某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為340以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為110，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對引物是可以接受的；6、Frq曲線為Oligo6軟件新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重復幾率大小，選取引物時，應該用Frq值相對較低的片段；7、引物二聚體及發(fā)卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR不能正常發(fā)生；8、3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG或CCC會導致錯誤的引發(fā)，同時3'端最后一個堿基最好不要是A或T，若是，會導致錯配；9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5計算Tm值，也就是退火溫度。

選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)；10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高。因為解鏈溫度也取決于它的長度，如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產(chǎn)物長5kb，則用24bp的引物；11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定（GC含量多），而3'端不穩(wěn)定（AT含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發(fā)反應；12、引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內(nèi)最好。

13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據(jù)需要添加保護堿基。

4.pcr引物的設計有哪些要求

你首先要明白，引物是什么？為什么要設計引物？明白了之后，再去看資料和網(wǎng)上設計引物的介紹，一定能明白。

關于設計引物的步驟和注意事項，網(wǎng)上太多了，我相信你不是問這個，我跟你介紹一下設計引物的意義，說說實驗里的作用吧。

基因都是串在基因組DNA或者載體上的，必須拿下來才能用，對吧？怎么拿下來呢？一般就是用PCR的方法，比如說有一串DNA鏈是這個樣子：

---------++++++--------------------------

其中【++++】部分是你要的片段，其它都不要，那就用PCR反復擴增+++部分，最后就得到大量的片段。

可是怎么讓PCR擴增的就是+++片段，而沒有其他---片段呢？就得靠引物——根據(jù)++++片段兩端的幾個DNA序列，人工合成兩個20來個堿基的短DNA，這段DNA可以和+++片段的兩端互補結合，就把PCR的范圍限定在兩個合成的短DNA中間了。

這個短DNA，就是引物

明白了引物是什么，是干什么用的，你就可以下手了，先在NCBI上查找你的基因的序列，根據(jù)兩頭的DNA序列，設計18-22個配對的堿基，讓公司去給你合成就行了。

當然，其中要注意的問題有很多，還涉及酶切位點等，你需要好好看書。

5.何謂PCR?PCR引物設計時有哪些注意事項（注：要考慮退火溫度）

答：（1） 聚合酶鏈式反應簡稱PCR（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）。

(2)PCR引物設計原則

設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：

② 引物長度

② GC含量，一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5'端加適量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃~6℃不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃~75℃間變化。

④ 避免擴增模板的二級結構區(qū)域

選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

⑤ 與靶DNA的錯配

⑥ 引物末端

引物3'端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3'端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應中，引物3′端不能發(fā)生錯配。如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。

⑦ 引物的二級結構

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。

⑧ 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配

5'端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當?shù)摹盃奚薄?/p>