pcr引物設(shè)計(jì)(PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)有哪些注意事項(xiàng))
1.PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)有哪些注意事項(xiàng)
引物設(shè)計(jì)參數(shù)：
a
引物長度一般在20bp左右，上下游引物堿基長度不要相差超過4個(gè)堿基。
b
引物退火溫度一般在58度，不同軟件TM使用不同的算法，primer3,primer
5,primer
6,primer
express等一般可以設(shè)置在55-58度，beacon
design可以設(shè)置在65左右。
c
GC含量一般沒什么特殊要求，40-60最好，如果不好設(shè)計(jì)，30-80也是可以的。
d
產(chǎn)物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區(qū)分，超過200bp可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率。
e
軟件給出的引物不能有發(fā)卡結(jié)構(gòu)和超過3-4個(gè)堿基的匹配，特別是3`端不能有堿基匹配，那樣更容易形成二聚體。
f
引物設(shè)計(jì)好以后，在NCBI上做一個(gè)primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴(kuò)增。
2.PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)該注意的問題?
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
3.PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循哪些原則
1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp;2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3、引物所對(duì)應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3'的下降形狀也有利于引物與模板的結(jié)合；4、ΔG值（自由能）反應(yīng)了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，3'端的ΔG值相對(duì)要低，且絕對(duì)值不要超過9，否則不利于正確引發(fā)反應(yīng)，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，但在-6時(shí)只達(dá)到40%,-8時(shí)少于20%,-10時(shí)接近于0;5、錯(cuò)配率一般不要超過100，否則會(huì)出現(xiàn)非目的條帶。
但對(duì)于某些特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為340以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為110，并且不好找到其他更合適的引物，那么這對(duì)引物是可以接受的；6、Frq曲線為Oligo6軟件新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，解釋了序列片段存在的重復(fù)幾率大小，選取引物時(shí)，應(yīng)該用Frq值相對(duì)較低的片段；7、引物二聚體及發(fā)卡結(jié)構(gòu)的能量的絕對(duì)值一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR不能正常發(fā)生；8、3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的引發(fā)，同時(shí)3'端最后一個(gè)堿基最好不要是A或T，若是，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配；9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5計(jì)算Tm值，也就是退火溫度。
選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度，最好保證每個(gè)引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)；10、模板與穩(wěn)定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高。因?yàn)榻怄湝囟纫踩Q于它的長度，如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產(chǎn)物長5kb，則用24bp的引物；11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定（GC含量多），而3'端不穩(wěn)定（AT含量多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)；12、引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內(nèi)最好。
13、對(duì)引物的修飾一般在5'端進(jìn)行，例如加酶切位點(diǎn)，加酶切位點(diǎn)的同時(shí)要根據(jù)需要添加保護(hù)堿基。
4.pcr引物的設(shè)計(jì)有哪些要求
你首先要明白，引物是什么？為什么要設(shè)計(jì)引物？明白了之后，再去看資料和網(wǎng)上設(shè)計(jì)引物的介紹，一定能明白。
關(guān)于設(shè)計(jì)引物的步驟和注意事項(xiàng)，網(wǎng)上太多了，我相信你不是問這個(gè)，我跟你介紹一下設(shè)計(jì)引物的意義，說說實(shí)驗(yàn)里的作用吧。
基因都是串在基因組DNA或者載體上的，必須拿下來才能用，對(duì)吧？怎么拿下來呢？一般就是用PCR的方法，比如說有一串DNA鏈?zhǔn)沁@個(gè)樣子：
---------++++++--------------------------
其中【++++】部分是你要的片段，其它都不要，那就用PCR反復(fù)擴(kuò)增+++部分，最后就得到大量的片段。
可是怎么讓PCR擴(kuò)增的就是+++片段，而沒有其他---片段呢？就得靠引物——根據(jù)++++片段兩端的幾個(gè)DNA序列，人工合成兩個(gè)20來個(gè)堿基的短DNA，這段DNA可以和+++片段的兩端互補(bǔ)結(jié)合，就把PCR的范圍限定在兩個(gè)合成的短DNA中間了。
這個(gè)短DNA，就是引物
明白了引物是什么，是干什么用的，你就可以下手了，先在NCBI上查找你的基因的序列，根據(jù)兩頭的DNA序列，設(shè)計(jì)18-22個(gè)配對(duì)的堿基，讓公司去給你合成就行了。
當(dāng)然，其中要注意的問題有很多，還涉及酶切位點(diǎn)等，你需要好好看書。
5.何謂PCR?PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)有哪些注意事項(xiàng)（注：要考慮退火溫度）
答：（1） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡稱PCR（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）。
(2)PCR引物設(shè)計(jì)原則
設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理：
② 引物長度
② GC含量，一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5'端加適量的A、T或G、C尾巴。
③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃~6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃~75℃間變化。
④ 避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域
選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。
⑤ 與靶DNA的錯(cuò)配
⑥ 引物末端
引物3'端是延伸開始的地方，因此要防止錯(cuò)配就從這里開始。3'端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。
⑦ 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
⑧ 為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配
5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚薄?/p>
