蛋白質(zhì)測定的方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)(常用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量的方法)
1.常用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無(wú)機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來(lái)并為過(guò)量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。
由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。
優(yōu)點(diǎn)：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對比較簡(jiǎn)單；實(shí)驗費用較低；結果準確，是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應，把低價(jià)氮氧化并轉為氨鹽來(lái)測定，而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。
當底物中含有肽鍵時(shí)（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過(guò)比色法分析濃度，在紫外可見(jiàn)光譜中的波長(cháng)為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質(zhì)單位1-10mg。
優(yōu)點(diǎn)：測定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。
缺點(diǎn)：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì )干擾該反應。
3、酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，不加標準蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于650nm波長(cháng)處測定各管中溶液的吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，對水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效。
缺點(diǎn)：①費時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數蛋白質(zhì)在280nm波長(cháng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。
取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長(cháng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。?
缺點(diǎn)：①測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，專(zhuān)一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì )出現較大的干擾。
5、考馬斯亮藍法
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質(zhì)結合后，其對可見(jiàn)光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。
在考馬斯亮藍 G-250 過(guò)量且濃度恒定的情況下，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí)，就會(huì )有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關(guān)系。
一般情況，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線(xiàn)性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來(lái)測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類(lèi)、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò )合劑的影響，適合大量樣品的測定。
缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差。
參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)測定
2.通常蛋白質(zhì)含量測定的方法有哪些,比較優(yōu)缺點(diǎn)
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。
考馬斯亮藍法（Bradford法）。 凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時(shí) 8~10小時(shí) 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時(shí)太長(cháng) 雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò )合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶； Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸； 各種硫醇 耗費時(shí)間長(cháng)；操作要嚴格計時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液； SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。
3.各種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)定量測定方法的優(yōu)缺點(diǎn)
一、凱氏（kjeldahl）定氮法
優(yōu)點(diǎn)： 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少優(yōu)點(diǎn)
①可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；
②操作相對比較簡(jiǎn)單；
③實(shí)驗費用較低；
④結果準確，是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；
⑤用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)
缺點(diǎn)
①最終測定的是總有機氮，而不只是蛋白質(zhì)氮；
②實(shí)驗時(shí)間太長(cháng)（至少需要2h才能完成）；
③精度差，精度低于雙縮脲法；
④所用試劑有腐蝕性.
靈敏度低 適用于0.2-1.0mg氮 干擾物質(zhì) ：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） ；費時(shí)太長(cháng)
二 Folin-酚試劑法
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應用得最廣泛的方法之一。
缺點(diǎn)是費時(shí)間較長(cháng)，要精確控制操作時(shí)間，標準曲線(xiàn)也不是嚴格的直線(xiàn)形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。
對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線(xiàn)。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì )色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。
此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。
此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
三、Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：
(1)靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。
(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點(diǎn)是：
(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作 標準曲線(xiàn)時(shí)通常選用 g—球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。
(3)標準曲線(xiàn)也有輕微的非線(xiàn)性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計算，而只能用標準曲線(xiàn)來(lái)測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
四 紫外吸收法
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。
缺點(diǎn)：測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線(xiàn)法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì )出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測定的結果還是存在一定的誤差。
五、雙縮脲法（Biuret法）
優(yōu)點(diǎn)：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)顯色相似
缺點(diǎn)：不太靈敏
4.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋 白質(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
5.各種蛋白互作檢測方法有哪些優(yōu)缺點(diǎn)
雙雜交技術(shù) 原理基于真核細胞轉錄因子的結構特殊性，這些轉錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨立的結構域組成。分別使結合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細胞中表達，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報告基因。 缺點(diǎn)：自身有轉錄功能的蛋白會(huì )造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì )影響蛋白的真實(shí)結構和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì )導致假隱性。
熒光共振能量轉移技術(shù) 指兩個(gè)熒光法色基團在足夠近（<100埃）時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉移的現象。熒光共振能量轉移技術(shù)可以研究分子內部對某些刺激發(fā)生的構象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構象變化，能夠定性定量的檢測相互作用的強度。 缺點(diǎn) 此項技術(shù)要求發(fā)色基團的距離小于100埃。另外設備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標記。 生化標記技術(shù)文檔，生化標記技術(shù)文檔下載，生物幫上面有介紹的。
6.標準曲線(xiàn)法與其他蛋白質(zhì)含量測定方法比較,有何優(yōu)缺點(diǎn)
標準曲線(xiàn)法又稱(chēng)校準曲線(xiàn)法，做法是將貯備標準液稀釋為所需要的標準系列，用零濃度調儀器零點(diǎn)后，依次由低到高濃度測量標準液的吸光度（或峰高、面積），同
時(shí)測定樣品和樣品空白的吸光度（或峰高、面積），在坐標紙上以標準液濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。它一般適用于已知樣品的基本成分
和標準液的基本成分相接近的樣品。
標準加入法是分別在數份相同體積樣品液中加入不等量的標準液，一定要有一份相同體積樣品液中加入
的標準液為零，按照上面繪制標準曲線(xiàn)的步驟測量吸光度（或峰高、面積），在坐標紙上以加入的標準液濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)，用
外推法（延長(cháng)標準曲線(xiàn)和橫坐標相交的數的絕對值）就可得到樣品液濃度。它一般適用于組份較復雜的未知樣品，能消除一些基本成份對測定的干擾，但對測定的未
知成分含量要粗略估計一下，加入的標準液要和樣品液濃度接近，
優(yōu)缺點(diǎn)：準確度較高，但是比較麻煩，要做很多標準溶液
