浸漬法:浸漬法是將原料用適當的溶劑在常溫或溫熱條件下浸泡出有效成分的一種方法。
具體做法是: 取適量粉碎后的原料,置于加蓋容器中,加入適量的溶劑并密蓋,間斷式攪拌或震搖,浸漬至規定時(shí)間使有效成分浸出。取上清夜,過(guò)濾,壓榨殘渣,合并濾液和壓榨液, 過(guò)濾濃縮至適宜濃度, 可進(jìn)一步制備流浸膏, 浸膏,片劑,沖劑等。
按提取溫度和浸漬的次數可分為冷浸潰法,熱浸潰法,重浸潰法。 滲漉法:滲漉法是將原料粗粉濕潤膨脹后裝入滲波器內,頂部用紗布覆蓋,壓緊,浸提溶劑連續地從滲漣器的上部加入, 溶劑滲過(guò)原料層往下流動(dòng)過(guò)程中將與有效成分浸出的一種辦法。
不斷加入新溶劑, 可以連續收集浸提液, 由于原料不斷與新溶劑或含有低濃度提取物的溶劑接觸, 始終保持一定的濃度差, 浸提效果要比浸潰法高,提取比較完全,但溶劑用量大。滲滾法可分為單滲漉法,重滲漉法,加壓滲漉法,逆滲漉法。
煎煮法:煎煮法是指用水作溶劑,將被提物加熱煮沸一定時(shí)間,以提取其所含成分的一種常用方法, 又稱(chēng)煮提法或煎浸法。 該法是將原料適當的切碎或粉碎成粗粉放入適當容器中,加水浸過(guò)原料面,充分浸泡后,加熱煎煮2一3 次,每次l h左右。
直火加熱,要不斷攪拌以免焦糊。分離并收集各次煎出液,經(jīng)離心分離或沉濾過(guò)后,濃縮至所需濃度。
該法使用于有效成分能溶于水, 對濕,熱均穩定且不易揮發(fā)的原料。 回流提取法: 回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取原料成分,將浸出液加熱蒸餾,其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻,重復流回浸出容器中浸提原料, 這樣周而復始,直至有效成分回流提取完全的方法。
回流法提取液在蒸發(fā)鍋中受熱時(shí)間較長(cháng),故不使用于受熱易破壞的原料成分的浸出。 連續提取法:為了彌補回流提取法中需要溶劑量大,操作較繁的不足,可采用連續提取法。
當提取的有效成分在所選溶劑中不宜溶解時(shí), 若采用回流提取需提十幾次, 既費時(shí)又過(guò)多耗費溶劑,在此情況下,可用連續回流提取法,用較少的溶劑一次提取便可提取完全。
蛋白質(zhì)的分離純化方法:
一、根據蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
1、蛋白質(zhì)的鹽析法:中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著(zhù)影響,一般在低鹽濃度下隨著(zhù)鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱(chēng)鹽溶;當鹽濃度繼續升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱(chēng)鹽析。
2、等電點(diǎn)沉淀法:蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉淀法:用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應在低溫下進(jìn)行。
二、根據蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾:透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。
2、凝膠過(guò)濾法: 也稱(chēng)分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。
三、根據蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離
1、電泳法:各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí),到達各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
2、離子交換層析法:離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素),當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。
四、根據配體特異性的分離方法-親和色譜法
親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質(zhì)與另一種稱(chēng)為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類(lèi)型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒(méi)的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái),因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
(一)溶劑提取法: 1.溶劑提取法的原理:溶劑提取法是根據中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì),選用對活性成分溶解度大,對不需要溶出成分溶解度小的溶劑,而將有效成分從藥材組織內溶解出來(lái)的方法。
當溶劑加到中草藥原料(需適當粉碎)中時(shí),溶劑由于擴散、滲透作用逐漸通過(guò)細胞壁透入到細胞內,溶解了可溶性物質(zhì),而造成細胞內外的濃度差,于是細胞內的濃溶液不斷向外擴散,溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細胞中,如此多次往返,直至細胞內外溶液濃度達到動(dòng)態(tài)平衡時(shí),將此飽和溶液濾出,繼續多次加入新溶劑,就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。 中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。
溶劑可分為水、親本性有機溶劑及親脂性有機溶劑,被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。 有機化合物分子結構中親水性基團多,其極性大而疏于油;有的親水性基團少,其。
極性小而疏于水。這種親水性、親脂性及其程度的大小,是和化合物的分子結構直接相關(guān)。
一般來(lái)說(shuō),兩種基本母核相同的成分,其分子中功能基的極性越大,或極性功能基數量越多,則整個(gè)分子的極性大,親水性強,而親脂性就越弱,其分子非極性部分越大,或碳鍵越長(cháng),則極性小,親脂性強,而親水性就越弱。 各類(lèi)溶劑的性質(zhì),同樣也與其分子結構有關(guān)。
例如甲醇、乙醇是親水性比較強的溶劑,它們的分子比較小,有羥基存在,與水的結構很近似,所以能夠和水任意混合。丁醇和戊醇分子中雖都有羥基,保持和水有相似處,但分子逐漸地加大,與水性質(zhì)也就逐漸疏遠。
所以它們能彼此部分互溶,在它們互溶達到飽和狀態(tài)之后,丁醇或戊醇都能與水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類(lèi)或氯烴衍生物,分子中沒(méi)有氧,屬于親脂性強的溶劑。
這樣,我們就可以通過(guò)時(shí)中草藥成分結構分析,去估計它們的此類(lèi)性質(zhì)和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物,具有強親水性,極易溶于水,就是在親水性比較強的乙醇中也難于溶解。
淀粉雖然羥基數目多,但分子大大,所以難溶解于水。蛋白質(zhì)和氨基酸都是酸堿兩性化合物,有一定程度的極性,所以能溶于水,不溶于或難溶子有機溶劑。
甙類(lèi)都比其甙元的親水性強,特別是皂甙由于它們的分子中往往結合有多數糖分子,羥基數目多,能表現出較強的親水性,而皂甙元則屬于親脂性強的化合物。多數游離的生物堿是親脂性化合物,與酸結合成鹽后,能夠離子化,加強了極性,就變?yōu)橛H水的注質(zhì),這些生物堿可稱(chēng)為半極性化合物。
所以,生物堿的鹽類(lèi)易溶于水,不溶或難溶于有機溶劑;而多數游離的生物堿不溶或難溶于水,易溶于親脂性溶劑,一般以在氯仿中溶解度最大。鞣質(zhì)是多羥基的化臺物,為親水性的物質(zhì)。
油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強親脂性的成分。 總的說(shuō)來(lái),只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項性質(zhì)相當,就會(huì )在其中有較大的溶解度,即所謂“相似相溶”的規律。
這是選擇適當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據之一。 2.溶劑的選擇:運用溶劑提取法的關(guān)鍵,是選擇適當的溶劑。
溶劑選擇適當,就可以比較順利地將需要的成分提取出來(lái)。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn):①溶劑對有效成分溶解度大,對雜質(zhì)溶解度小;②溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化;③溶劑要經(jīng)濟、易得、使用安全等。
3.提取方法:用溶劑提取中草藥成分,、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續回流提取法等。同時(shí),原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設備條件等因素也都能影響提取效率,必須加以考慮。
1)浸漬法:浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人適當的容器中,加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水),浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡(jiǎn)單易行,但浸出率較差,且如用水為溶劑,其提取液易于發(fā)霉變質(zhì))須注意加入適當的防腐劑。
2)滲漉法:滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中,不斷添加新溶劑,使其滲透過(guò)藥材,自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法小當溶劑滲進(jìn)藥粉溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí),上層的溶液或稀浸液便置換其位置,造成良好的濃度差,使擴散能較好地進(jìn)行,故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應控制流速,在滲渡過(guò)程中隨時(shí)自藥面上補充新溶劑,使藥材中有效成分充分浸出為止。
或當滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當于:原藥材重的10倍時(shí),便可認為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀滲淮液作為另一批新原料的溶劑之用。
3)煎煮法:煎煮法是我國最早使用的傳統的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿,不宜用鐵鍋,以免藥液變色。
直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌,以免局部藥材受熱太高,容易焦糊。有蒸汽加熱設備的藥廠(chǎng),多采用大反應鍋、大銅鍋、大木桶,或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。
還可將數個(gè)煎煮器通過(guò)管道互相連接,進(jìn)行連續煎浸。 4)回流提取法:應用有機溶劑加熱提取,需采用回流加熱裝置,以免溶劑揮發(fā)損失。
小量操作時(shí),可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶?jì)妊b藥材約為容量的%~%,溶劑浸過(guò)藥材表面約1~2cm。
在水浴中加熱回流,一般保持沸騰約:小時(shí)小放冷過(guò)濾,再在藥渣中加溶劑,作。
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