基因工程轉化方法(基因工程中轉化的方法)

1.基因工程中轉化的方法有哪些

通過(guò)轉化將載體DNA導入受體菌繼而得到含有目的DNA插入的轉化菌株是構建DNA文庫最為關(guān)鍵的一步。

化學(xué)法（化學(xué)藥物如氯化鈣等）轉化

氯化鈣法轉化細胞 細菌處于0℃及CaCl2低滲溶液中時(shí)，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理促進(jìn)細胞吸收DNA復合物。

直接分離基因最常用的方法是“鳥(niǎo)槍法”，又叫“散彈射擊法”。具體做法：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過(guò)運載體分別載人不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在各個(gè)受體細胞中大量復制（在遺傳學(xué)中叫擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來(lái)。但這種方法工作量大，具有一定的盲目性。20世紀80年代以后，隨著(zhù)DNA核苷酸序列分析技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以通過(guò)DNA序列自動(dòng)測序儀對提取出的基因進(jìn)行核苷酸序列分析，并且通過(guò)一種擴增DNA的新技術(shù)（也叫PCR技術(shù)），使目的基因片段在短時(shí)間內成百萬(wàn)倍地擴增。上述新技術(shù)的出現大大簡(jiǎn)化了基因工程的操作技術(shù)。

2.轉基因技術(shù)的轉化方法

遺傳轉化的方法按其是否需要通過(guò)組織培養、再生植株通常可分成兩大類(lèi)，第一類(lèi)需要通過(guò)組織培養再生植株，常用的方法有農桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類(lèi)方法不需要通過(guò)組織培養，比較成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中國科學(xué)家提出的。

農桿菌介導轉化農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌中細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。

因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實(shí)現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過(guò)細胞和組織培養技術(shù)，再生出轉基因植株。

農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，自從技術(shù)瓶頸被打破之后，農桿菌介導轉化在單子葉植物中也得到了廣泛應用，其中水稻已經(jīng)被當作模式植物進(jìn)行研究。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開(kāi)花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著(zhù)受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個(gè)體。

該方法于80年代初期由中國學(xué)者周光宇提出，中國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲(chóng)棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴(lài)組織培養人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗室，常規育種工作者易于掌握。

核顯微注射法核顯微注射法是動(dòng)物轉基因技術(shù)中最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因注射到受精卵細胞的原核內，注射的外源基因與胚胎基因組融合，然后進(jìn)行體外培養，最后移植到受體母畜子宮內發(fā)育，這樣分娩的動(dòng)物體內的每一個(gè)細胞都含有新的DNA片段。

-這種方法的缺點(diǎn)是效率低、位置效應（外源基因插入位點(diǎn)隨機性）造成的表達結果的不確定性、動(dòng)物利用率低等，在反芻動(dòng)物還存在著(zhù)繁殖周期長(cháng)，有較強的時(shí)間限制、需要大量的供體和受體動(dòng)物等特點(diǎn)。詳細步驟：在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過(guò)DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。

用這種方法生產(chǎn)的動(dòng)物約有十分之一是整合外源基因的轉基因動(dòng)物。基因槍法利用火藥爆炸或高壓氣體加速（這一加速設備被稱(chēng)為基因槍?zhuān)瑢藥康幕虻腄NA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然后通過(guò)細胞和組織培養技術(shù)，再生出植株，選出其中轉基因陽(yáng)性植株即為轉基因植株。

與農桿菌轉化相比，基因槍法轉化的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構建也相對簡(jiǎn)單，因此也是轉基因研究中應用較為廣泛的一種方法。

精子介導法精子介導的基因轉移是把精子作適當處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給發(fā)情母畜授精。

在母畜所生的后代中，就有一定比例的動(dòng)物是整合外源基因的轉基因動(dòng)物。同顯微注射方法相比，精子介導的基因轉移有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10。

其次，由于它不涉及對動(dòng)物進(jìn)行處理，因此，可以用生產(chǎn)牛群或羊群進(jìn)行實(shí)驗，以保證每次實(shí)驗都能夠獲得成功。核移植轉基因法體細胞核移植是一種轉基因技術(shù)。

該方法是先把外源基因與供體細胞在培養基中培養，使外源基因整合到供體細胞上，然后將供體細胞細胞核移植到受體細胞——去核卵母細胞，構成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉基因的克隆動(dòng)物。體細胞核移植法先在體外培養的體細胞中進(jìn)行基因導入，篩選獲得帶轉基因的細胞。

然后，將帶轉基因體細胞核移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產(chǎn)重構胚胎。重構胚胎經(jīng)移植到母體中，產(chǎn)生的仔畜百分之百是轉基因動(dòng)物。

3.基因工程包括哪些步驟

基因工程的主要操作步驟包括：⑴目的基因的制備，所謂目的基因就是按照設計所需要轉移的具有遺傳效應的DNA片段。

目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸內切酶從基因組中直接切割得到。⑵目的基因與克隆載體的重組，所謂克隆載體就是承載和保護目的基因帶入受體細胞的運載者，如質(zhì)粒，λ噬菌體，病毒等。

⑶重組體轉入受體細胞，所謂受體細胞就是接受外源目的基因的細胞，大腸桿菌是用得最多的原核細胞受體，另外，動(dòng)物細胞、植物細胞都可作為受體細胞，把帶有目的基因的重組體轉入受體細胞要用到各種物理的、化學(xué)的和生物的方法。⑷克隆子的篩選和鑒定，帶有目的基因的克隆子有沒(méi)有組合到受體細胞的基因組中去，目的基因有沒(méi)有在宿主細胞中通過(guò)轉錄、翻譯表達出預先設計中想要得到的產(chǎn)物和表達產(chǎn)物如何分離、純化等技術(shù)內容。