細胞室使用(細胞療法標本采集注意事項)

1.細胞療法標本采集注意事項有哪些?

(1) 采集標本前，先認真核對，準備好專用的無菌容器和酒精燈等；檢查容器有無裂縫、瓶塞有無松動、培養(yǎng)基是否足夠、培養(yǎng)液有無渾濁和變質(zhì)等；填寫瓶簽，在無菌容器外面貼上瓶簽，標明科室、床號、姓名、性別、住院號或ID號、治療目的 （細胞類別）、抽血量、送檢日期和時間等。

（2） 采集標本前、中、后及制備操作前均應(yīng)仔細“三查八對”，逐項核查，以免發(fā)生差錯，并向患者說明抽血的相關(guān)注意事項及回輸?shù)臅r間，以消除顧慮，取得患者及其家屬配合。 （3） 采集的標本，均須及時放入無菌容器內(nèi)，禁止左右、上下?lián)u動和振動，只需用雙手心輕輕揉搓即可；采集標本時應(yīng)嚴格執(zhí)行無菌操作，不可混入防腐劑、消毒劑及其他藥物，以免影響細胞制備的結(jié)果；封蓋前用酒精燈常規(guī)滅菌瓶蓋和瓶口加蓋固封。

對疑有菌血癥、敗血癥等的患者，不應(yīng)作為細胞供體。 （4） 釆集各種標本均應(yīng)按照操作規(guī)程進行，做到及時采集， 標本新鮮，量準確，注意及時送往細胞培養(yǎng)室，不應(yīng)放置過久， 以免影響細胞制備的效能，特殊標本要有特殊注明。

2.分子生物學(xué)體外細胞培養(yǎng)具體操作過程和注意事項

一、準備工作 準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

四、凍存及復(fù)蘇 為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

五、常用儀器設(shè)備 無菌室，超凈工作臺，三重純水蒸餾器，抽氣泵，壓力蒸氣消毒器，電熱恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，倒置顯微鏡，離心機，無菌過濾器，洗刷裝置，細胞計數(shù)板和電子細胞技術(shù)儀等等。

3.觀察植物細胞時顯微鏡使用注意事項

1.右手握住鏡臂，左手托住鏡座。

2.把顯微鏡放在實驗臺上，略偏左（顯微鏡放在距實驗臺邊緣7厘米左右處）。安裝好目鏡和物鏡。

二、對光 3.轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對準通光孔（物鏡的前端與載物臺要保持2厘 米的距離）。 4.把一個較大的光圈對準通光孔。

左眼注視目鏡內(nèi)（右眼睜開，同時畫圖）。轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線通過通光孔反射到鏡筒內(nèi)。

通過目鏡，可以看到白亮的視野。 三、觀察 5.把所要觀察的玻片標本（也可以用印有“6”字的薄紙片制成）放在載物臺上，用壓片夾壓住，標本要正對通光孔的中心。

6.轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標本為止（眼睛看著物鏡，以免物鏡碰到玻片標本）。 7.左眼向目鏡內(nèi)看，同時反方向轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，使鏡筒緩緩上升，直到看清物像為止。

再略微轉(zhuǎn)動細準焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 注意事項：實驗完畢，把顯微鏡的外表擦拭干凈。

轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，把兩個物鏡偏到兩旁，并將鏡筒緩緩下降到最低處。最后把顯微鏡放進鏡箱里，送回原處。

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