單孢分離法的(黑木耳的分離單孢方法是什么?)

1.黑木耳的分離單孢方法是什么?

分離單孢的方法很多，有平板稀釋法、平板劃線(xiàn)分離法、稀釋涂布法、液滴分離法、毛細管分離法等。

我們采用的是平 板稀釋法，即將收集到的木耳孢子用無(wú)菌水稀釋至合適濃度， 將孢子懸液接入平皿中培養，待孢子萌發(fā)后挑取大量單菌落， 接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，培養基中插有蓋玻片。菌絲萌 發(fā)后取出玻片一一鏡檢，將無(wú)鎖狀聯(lián)合的單核菌絲編上號作 雜交材料。

將兩個(gè)不同親本經(jīng)鏡檢無(wú)鎖狀聯(lián)合的單核菌絲A, B分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基試管的上下部，待兩 單核菌絲生長(cháng)相遇時(shí)，取連接處的一小塊菌絲（經(jīng)鏡檢有鎖狀 聯(lián)合者即為雜交菌絲C）接種于另一空白培養基試管中央，在 它的上下部分別接兩個(gè)親本菌絲A和B，觀(guān)察雜交菌絲C與 親本菌絲A,B有無(wú)拮抗線(xiàn)。如有明顯的拮抗線(xiàn)，即表示該配 對為雜交菌絲，則保留；沒(méi)有拮抗線(xiàn)而長(cháng)到一起的不是雜交菌 絲，則淘汰。

2.草菇單孢分離法育種方法是什么?

單孢分離是一種可以獲得純菌種的方法，主要就是將采集到的孢子群分開(kāi)培養，讓它們單獨萌發(fā)成菌絲。

通過(guò)對草菇進(jìn)行有性分離育種，然后選育出草菇菌株。表明草菇的孢子分離菌株，不管是在菌絲形態(tài)，還是生長(cháng)速度和產(chǎn)厚垣孢子的能力方面，以及出菇率和產(chǎn)量等性狀上都存在比較大的差異。

我們可以在菌絲生長(cháng)比較濃密的地方及能產(chǎn)生大量厚垣孢子的菌株中，選擇到產(chǎn)量較高的菌株在生產(chǎn)中應用，可以在一定程度上解決草菇生產(chǎn)上出現的菌種老化、退化問(wèn)題。單孢分離法主要的步驟：菇種的選擇首先是對藤種進(jìn)行選擇，并進(jìn)行一系列的消毒處理。

努力收集質(zhì)量比較好的單孢子。 單孢子的分離和涂布選擇一種適合自己的方法獲得單孢子，并對單孢子進(jìn)行分離，單孢子的分離可采用單孢子分離器法和平板劃線(xiàn)分離法。

然后進(jìn)行孢子涂布，在滅菌培養基上把獲得的單孢子均勻涂開(kāi)。單孢子培養在保持溫度大約在35℃-40℃恒溫下，把單孢子培養至長(cháng)成純菌絲，然后按可育性菌株的培養特征，把符合條件的菌株留作母種。

擴大母種把培養好的單孢子擴大培養成原種和生產(chǎn)種。出菇測驗把母種培養成原種和生產(chǎn)種后，就要開(kāi)始對出菇進(jìn)行試驗，經(jīng)過(guò)初篩和復篩，把出菇早、出菇均勻、粒大、菇形好、產(chǎn)量高的菌種篩選保留。

選擇一小塊試驗田進(jìn)行試種，檢驗出菇率的穩定性。小面積試種成功后，就可擴大實(shí)驗田的面積，繼續進(jìn)行出菇率的確認。

最后就是把經(jīng)過(guò)確認的菇種，大面積推廣應用。

3.菌種孢子分離應怎樣操作

孢子分離為有性繁殖，所獲菌種已經(jīng)發(fā)生遺傳重組等變 異，生產(chǎn)性狀有可能優(yōu)于母體，也有可能劣于母體。

孢子分 離有單孢分離和多孢分離兩種方法，單孢分離主要用于遺傳育種研究，多孢分離多用于生產(chǎn)繁種。孢子分離技術(shù)如下：懸菇彈孢法：采集剛彈射孢子的子實(shí)體菌蓋，在無(wú)菌室經(jīng)消毒處理 后，將菌褶朝下懸吊于無(wú)菌容器內收集孢子，在22度?26°度 下讓其自然彈射孢子5?10小時(shí)，容器底部出現白色孢子 印。

取無(wú)菌水粘取少量孢子制成孢子懸浮液，用滅過(guò)菌的注射器或滴管吸取孢子懸浮液，滴1?2滴于試管斜面上，經(jīng) 25°度培養至孢子萌發(fā)，挑選無(wú)污染的斜面進(jìn)行擴繁，經(jīng)過(guò)嚴 格的出菇試驗，擇優(yōu)用于生產(chǎn)。褶片粘貼法：在無(wú)菌條件下，選取一小塊子實(shí)體組織，蘸少量無(wú)菌瓊 脂或漿糊，粘附于試管培養基斜面的對面玻壁上，加棉塞后 在20度左右靜置，菌孔組織中的孢子會(huì )彈射到斜面培養基 上，再去掉試管壁上的菌塊，進(jìn)一步培養獲得多孢子萌發(fā)的 菌絲體。

4.什么是孢子分離法

孢子分離法也稱(chēng)為孢子彈射分離法，是利用某些藥用真菌子實(shí)體成熟后自行彈射孢子的特性，在無(wú)菌條件下，使彈射的孢子落到適宜培養基上，在適宜條件下進(jìn)行培養，孢子萌發(fā)成菌絲，從而獲得純菌種的一種方法。

（1） 分離材料的選擇與消毒孢子分離材料，來(lái)自于多年人工栽培的優(yōu)良品系和野生的種菇。 在同一個(gè)生長(cháng)條件下，栽培同一種藥用真菌不同的品系，其生產(chǎn)效益和品質(zhì)有很大差異；而同一個(gè)品系栽培在不同的環(huán)境條件下，其優(yōu)良性狀表現也不同，就是在相同環(huán)境條件下栽培的同一個(gè)品系，其單株之間也會(huì )出現差異。

因此，應選擇長(cháng)期栽培的優(yōu)良品種的優(yōu)良單株作為分離材料。 野生的菌株，未經(jīng)過(guò)人工栽培，不知其優(yōu)良性狀、抗逆能力和生產(chǎn)性能如何，只能作為育種搜集原始材料時(shí)進(jìn)行孢子分離，經(jīng)過(guò)培養品系之間對比試驗，選擇優(yōu)良者進(jìn)行生產(chǎn)，在選優(yōu)去劣的培養過(guò)程中，再在群體中選擇優(yōu)良個(gè)體，作為孢子分離的材料。

理想的種菇應該是具有該品種主要典型的特征，發(fā)育正常，個(gè)體健壯，無(wú)病蟲(chóng)害，成熟適度的子實(shí)體。 種菇選定后，可將其周?chē)?10厘米左右范圍內的小菇全部摘除，適當增加噴水量，有的藥用真菌子實(shí)體有菌幕包著(zhù)，即可待種菇有八、九分成熟時(shí)，及時(shí)采摘進(jìn)行消毒。

可剪去菌柄的三分之二，用清水洗去黏附的污物，浸入0。 1%的升汞溶液中1~2分鐘或在70%的酒精中浸幾秒到1分鐘，取出后用無(wú)菌水反復沖洗數次，用滅菌的紗布或濾紙吸干表面水分后待用。

有些藥用菌如香菇的子實(shí)體，很小時(shí)菌幕就被拉開(kāi)；或有的種類(lèi)根本無(wú)菌幕，菌褶裸露于空氣中，很難避免有雜菌孢子附著(zhù)在菌褶上，則應采摘成熟的子實(shí)體，剪去三分之二的菌柄，用 75%的酒精揩擦菌蓋及菌柄表面，并在插人孢子收集器后6~12小時(shí)內，種菇孢子已彈出而附在上面的雜菌孢子短時(shí)間內還未脫落時(shí)取出子實(shí)體。 而對于膠質(zhì)菌類(lèi)的子實(shí)體，只能用無(wú)菌水洗滌，用無(wú)菌紗布吸干表面水分后待用。

（2） 孢子的采集種菇經(jīng)消毒處理后，即可采用以下方法收集孢子。孢子彈射采集法：利用孢子自動(dòng)彈射出子實(shí)層的特性，采集孢子。

一般采用整株插種法、三角瓶鉤懸法和試管貼附法，全部操作過(guò)程都應該在無(wú)菌條件下進(jìn)行。 ① 整株插種法：適于傘菌類(lèi)孢子的采集。

首先應準備好孢子采集器，用搪瓷盤(pán)或大于鐘罩的培養皿作底盤(pán)，上面放一個(gè)小培養皿，皿內放一個(gè)不銹鋼的支架，用鐘罩蓋在小培養皿上，將整套孢子采集器用雙層紗布或報紙包好，經(jīng)高壓滅菌后備用。在無(wú)菌條件下打開(kāi)孢子采集器，揭去鐘罩，為了防止鐘罩與培養皿接觸處雜菌侵人和增加采集器內部的濕度，在大培養皿內鋪 2~3層滅菌的紗布或脫脂棉，倒人0。

1 %的升汞液，以浸濕紗布為度，然后放人小培養皿，將消毒后的子實(shí)體插在支架上蓋鐘罩后，根據不同分離對象，移至18~25°C條件下，培養6小時(shí)至2天，待小皿內彈射并沉積一層孢子后，移入無(wú)菌室，先用75%的酒精或0。1%升汞擦拭鐘罩外部，打開(kāi)鐘罩取出子實(shí)體，小培養皿加蓋密封，供分離用。

② 三角瓶鉤懸法：適用于不具菌柄子實(shí)體孢子的采集，如膠質(zhì)菌銀耳、木耳等。在無(wú)菌條件下，將耳片用無(wú)菌水沖洗數次后，用無(wú)菌紗布吸干水分，將耳片掛在金屬鉤上，鉤子的另一端掛在三角瓶口上，瓶?jì)妊b有PDA培養基，加棉塞，置25°C溫度下培養 1~2天，當培養基表面有一層孢子粉時(shí)，把三角瓶拿到無(wú)菌室取出耳片和鉤子，仍塞好棉塞繼續培養。

③ 貼附法：取一塊經(jīng)消毒的成熟菌褶或耳片，用滅菌的瓊脂或漿糊，黏附在裝有PDA培養基的試管斜面或培養皿皿蓋正上方，加棉塞或蓋皿蓋后置室溫下培養，待孢子自然落下后，在無(wú)菌室內懾除菌褶或耳片，或將落有孢子的培養基轉移在新的試管斜面及培養皿平板培養基上，加塞或加蓋后繼續培養。 ④ 孢子印采集法：取成熟的子實(shí)體經(jīng)表面消毒后，切去菌柄，置于滅過(guò)菌的白色或黑色蠟光紙上，罩上通氣鐘罩，在24°C下靜置數小時(shí)后，輕輕移去種菇，可見(jiàn)有大量孢子落在紙上。

將有孢子印的紙在無(wú)菌條件下保存備用。⑤ 菌褶涂抹法：在接種室內，將成熟的子實(shí)體表面消毒，去掉菌柄，用消毒的接菌環(huán)插入兩片菌褶之間，輕輕涂抹褶片，將尚未彈射的孢子沾在接種環(huán)上，然后用劃線(xiàn)法接種在準備好的斜面培養基上或平板培養基上。

操作時(shí)，要嚴格在無(wú)菌條件下，動(dòng)作要準確。⑥ 空中孢子捕捉法：傘菌子實(shí)體成熟后，孢子大量彈射，在子實(shí)體周?chē)梢?jiàn)煙霧狀的“孢子云”，將準備好的培養基平板或試管口迎著(zhù)“孢子云”方向，使孢子附著(zhù)在培養基表面，隨即蓋上皿蓋或加棉塞即可。

（3） 孢子的分離采集到的孢子，一般需要經(jīng)過(guò)分離選擇后，才能制作原種。 孢子的分離根據接種到培養基上的孢子數量而分單孢分離和多孢分離兩種。

有些菇類(lèi)的孢子，具有單孢結菇的能力，可采用單孢分離純菌種的方法；有些種類(lèi)如香菇、木耳、金針菇等藥用真菌的單孢菌絲，只有經(jīng)過(guò)質(zhì)配后才能結菇，多采用多孢分離法，多孢分離方法簡(jiǎn)單、易操作、沒(méi)有不孕現象，在生產(chǎn)上常采用；但不能選擇優(yōu)良單孢繁殖后代，如果進(jìn)行雜交育種時(shí)，仍應進(jìn)行單孢分離。 單孢分離：從采集到的孢子群中，挑出單個(gè)孢子進(jìn)行培養，單。