pcr實(shí)時(shí)熒光結(jié)果分析(實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟是什么)
1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟是什么
變性→退火→延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，答：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。
隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。我們實(shí)驗(yàn)室用BIOG 染料法熒光定量PCR和BIOG探針?lè)晒舛縋CR測(cè)得的擴(kuò)增曲線起跳值一般在30左右，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
2.熒光定PCR中的注意事項(xiàng)
影響熒光PCR的因素很多，但從操作和技術(shù)上來(lái)講應(yīng)該要注意一下幾點(diǎn)：
1. RNA的完整性
因?yàn)镽NA一旦降解所定量的結(jié)果就不能正確反映樣品中mRNA的量，所得的結(jié)果也是錯(cuò)誤的。所以在RNA提取過(guò)程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，避免RNA酶的污染。
2. RNA樣品中的基因組DNA污染
提取的RNA樣品中不可避免地混有少量的基因組DNA。基因組DNA對(duì)試驗(yàn)有兩個(gè)影響：一是影響對(duì)RNA的精確定量；二是影響PCR擴(kuò)增的特異性。
3. PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
PCR擴(kuò)增過(guò)程必須保證擴(kuò)增產(chǎn)物只有特異的目標(biāo)產(chǎn)物，為此，首先要保證PCR反應(yīng)體系達(dá)到最優(yōu)。目前許多公司都有用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的試劑盒，可以方便PCR反應(yīng)的操作。
4. 反轉(zhuǎn)錄
反轉(zhuǎn)錄所得cDNA的量必須精確地等于相應(yīng)的mRNA的量，反轉(zhuǎn)錄對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)說(shuō)是非常關(guān)鍵的一步。目前常用的反轉(zhuǎn)錄酶有2種：AMV-RT和MMLV-R。反轉(zhuǎn)錄常用的引物有隨機(jī)引物、Oligo-dT和特異引物。相比之下Oligo-dT和特異性引物更適合實(shí)時(shí)定量PCR。
5.利用實(shí)時(shí)定量PCR研究基因表達(dá)時(shí)，一般用相對(duì)定量的方法相對(duì)定量必須用到內(nèi)標(biāo)基因?？煽康膬?nèi)標(biāo)基因應(yīng)是在不同細(xì)胞類型、不同試驗(yàn)條件下都穩(wěn)定表達(dá)的持家基因。常用的內(nèi)標(biāo)基因有β-tublin、actin、
GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。盡管在大多數(shù)情況下這些持家基因的表達(dá)非常穩(wěn)定，但是
最近有報(bào)道認(rèn)為這些持家基因的表達(dá)在某些情況下會(huì)發(fā)生變化。也就是說(shuō)并不是任何內(nèi)標(biāo)基因都適合
任何試驗(yàn)。在選擇內(nèi)標(biāo)基因時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮各種因素，選擇合適的內(nèi)標(biāo)基因或內(nèi)標(biāo)基因組合。
