ip免疫共沉淀(請教做過免疫共沉淀的高手們談?wù)勗摲椒ê陀猛?

1.請教做過免疫共沉淀的高手們談?wù)勗摲椒ê陀猛?/h2>

飛秒檢測發(fā)現(xiàn)免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當(dāng)用預(yù)先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進(jìn)行檢測，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

免疫沉淀實驗的操作步驟比較多，同時由于在非變性條件下進(jìn)行實驗，所以要得到一個完美的實驗結(jié)果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，同時對免疫沉淀體系也需要有嚴(yán)格的控制指標(biāo)。免疫沉淀實驗從：蛋白樣品處理；抗體-agarose beads孵育；抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌到最后的鑒定，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實驗流程中每個關(guān)鍵步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實驗?zāi)康摹?/p>

其優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。

2.什么是免疫共沉淀

免疫共沉淀基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，體外驗證兩種分子之間是否存在相互作用的技術(shù)。它是免疫沉淀的延伸?；驹硎窃诤幸阎乖募?xì)胞裂解液中，將已知抗原作為靶蛋白，檢測裂解液中可能存在與之有相互作用的蛋白。加入特定的抗體以及Protein A-Beads，會形成“抗原-抗體-Protein A-Beads”的復(fù)合物。在抗原抗體特異性結(jié)合沉淀靶蛋白的同時，存在相互作用的蛋白也能被沉淀下來，最終得到“蛋白-蛋白”的復(fù)合物。驗證是否有相互作用蛋白的存在。

免疫沉淀與免疫共沉淀實驗原理及方法大致相似，所不同的是在免疫共沉淀中對靶蛋白的結(jié)合由另一個與之發(fā)生相互作用的蛋白所替代。因此實驗屬于IP還是Co-IP取決于實驗的目標(biāo)是目的抗原還是相互作用蛋白質(zhì)。