分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(請(qǐng)問(wèn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般有哪些注意事項(xiàng)?)
1.請(qǐng)問(wèn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般有哪些注意事項(xiàng)?
分子生物學(xué)操作中會(huì)涉及一系列儀器，使用不當(dāng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗、減少儀器使用壽命或損壞儀器。
因此在進(jìn)行操作前細(xì)致地了解各種儀器的使用方法及注意事項(xiàng)，是使后繼實(shí)驗(yàn)事半功倍的一個(gè)必要準(zhǔn)備。冷凍離心機(jī) 低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。
基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中，都離不開(kāi)低溫離心技術(shù)，因此低溫冷凍離心機(jī)已成為分子生物學(xué)研究中必需的重要工具。使用方法：1.離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，并力求使機(jī)器處于水平位置以免離心時(shí)造成機(jī)器震動(dòng)。
2.打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，按要求裝上所需的轉(zhuǎn)頭，將預(yù)先以托盤(pán)天平平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上（離心筒須與樣品同時(shí)平衡），關(guān)閉機(jī)蓋。3.按功能選擇鍵，設(shè)置各項(xiàng)要求：溫度、速度、時(shí)間、加速度及減速度，帶電腦控制的機(jī)器還需按儲(chǔ)存鍵，以便記憶輸入的各項(xiàng)信息。
4.按啟動(dòng)鍵，離心機(jī)將執(zhí)行上述參數(shù)進(jìn)行運(yùn)作，到預(yù)定時(shí)間自動(dòng)關(guān)機(jī)。5.待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)后打開(kāi)機(jī)蓋，取出離心樣品，用柔軟干凈的布擦凈轉(zhuǎn)頭和機(jī)腔內(nèi)壁，待離心機(jī)腔內(nèi)溫度與室溫平衡后方可蓋上機(jī)蓋。
注意事項(xiàng)：1.機(jī)體應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線。2.開(kāi)機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔有無(wú)異物掉入。
3.樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。4.揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏，以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。
5.擦拭離心機(jī)腔時(shí)動(dòng)作要輕，以免損壞機(jī)腔內(nèi)溫度感應(yīng)器。6.每次操作完畢應(yīng)作好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。
7.離心過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，應(yīng)立即關(guān)閉電源，報(bào)請(qǐng)有關(guān)技術(shù)人員檢修。附：相對(duì)離心力與每分鐘轉(zhuǎn)速的換算 離心機(jī)的轉(zhuǎn)速，在以前實(shí)驗(yàn)資料中一般以每分鐘多少轉(zhuǎn)來(lái)表示。
由于離心力不僅為轉(zhuǎn)速函數(shù)，亦為離心半徑的函數(shù)，即轉(zhuǎn)速相同時(shí)，離心半徑越長(zhǎng)，產(chǎn)生的離心力越大。因此僅以轉(zhuǎn)速表達(dá)離心力是不夠科學(xué)的，近年來(lái)主張用相對(duì)離心力（RCF）來(lái)表示比較合理。
現(xiàn)在國(guó)際資料中，已改用相對(duì)離心力來(lái)表示。兩者的互換公式如下：PCR擴(kuò)增儀：目前各公司提供的PCR儀操作方法各有不同，按其操作說(shuō)明進(jìn)行操作。
值得提出的是，在使用一定時(shí)期后，樣品孔的實(shí)際溫度與儀器顯示溫度有時(shí)會(huì)有較大差異，應(yīng)當(dāng)請(qǐng)廠商的技術(shù)支持人員校對(duì)儀器的各項(xiàng)性能。數(shù)字式酸度計(jì)：一、準(zhǔn)備工作1.儀器應(yīng)平放在符合使用環(huán)境的工作臺(tái)上，依視覺(jué)角度支起支架。
3.pH值的定位測(cè)量法：（一）二點(diǎn)定位法（高精度測(cè)量方法）（1） 連接好電極線路，將參比電極及活化滿24h以上清潔的PH電極移入第一標(biāo)準(zhǔn)緩沖液pH1中（例pH1=4.00），待儀器響應(yīng)穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)定位旋鈕至儀器顯示為“0.00”;(2) 將電級(jí)系統(tǒng)從第1種標(biāo)準(zhǔn)液中取出，用去離子水沖洗干凈后以濾紙吸干電級(jí)表面水份，移入第2種標(biāo)準(zhǔn)液（例pH2=9.18）中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)斜率旋鈕，使儀器顯示為（△pH=pH1-pH2=9.18-4.00=5.18）此后斜率旋鈕不可再動(dòng)，除非更換電極系統(tǒng)；（3） 斜率調(diào)節(jié)完成后，重新調(diào)節(jié)定位旋鈕，使儀器顯示第2種標(biāo)準(zhǔn)液的實(shí)際pH值（9.18），至此2點(diǎn)定位結(jié)束；（4） 將電極從第2種標(biāo)準(zhǔn)液中取出沖洗、吸干后移入待測(cè)溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后顯示的數(shù)值即為待測(cè)溶液的pH值。（二）一點(diǎn)定位法（粗略測(cè)量法）（1） 將溫度補(bǔ)償旋鈕調(diào)至溶液溫度值；（2） 向左將斜率補(bǔ)償旋鈕旋轉(zhuǎn)至頭；（3） 將電級(jí)系統(tǒng)移入標(biāo)準(zhǔn)液中（一點(diǎn)法僅用一種標(biāo)準(zhǔn)液，如pH=4.00時(shí)），調(diào)節(jié)定位旋鈕使儀器顯示“4.00”;(4) 取出電級(jí)沖洗吸干水分后移至待測(cè)溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后顯示的數(shù)值即為待測(cè)溶液的pH值。
三、溫度的測(cè)量1.將功能選擇撥至溫度檔。2.將溫度探頭插入插孔，并將溫度探頭置于環(huán)境條件或溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后儀器顯示值即為環(huán)境條件或溶液溫度值。
四、注意事項(xiàng)1.認(rèn)真做好儀器使用前準(zhǔn)備工作。2.儀器通電后或測(cè)量過(guò)程中出現(xiàn)顯示不穩(wěn)或亂跳現(xiàn)象，應(yīng)切斷電源進(jìn)行檢查，如電壓、預(yù)熱時(shí)間及電極系統(tǒng)等是否正常。
3.使用不同電極應(yīng)注意排除離子的干擾，選擇好鹽橋，必要時(shí)應(yīng)使用離子強(qiáng)度固定劑。4.電極系統(tǒng)從第1種溶液取出移入第2種溶液之前，須用去離子水或雙蒸水清洗干凈，再用濾紙吸干表面水分，以免影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
5. 儀器應(yīng)存放于干燥、清潔無(wú)腐蝕的場(chǎng)所，每次測(cè)量結(jié)束后應(yīng)關(guān)閉電源，退出電極及溫度探頭妥善保存。玻璃電極清洗后可浸于去離子水待用（注意水面不得低于玻璃球泡），甘汞電極清潔后套上橡皮帽置于配套盒中保存，當(dāng)甘汞電極內(nèi)充液泄漏或不飽和及鹽橋中斷時(shí)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充飽和內(nèi)充液。
6.該類(lèi)儀器均采用大規(guī)模集成電路，輸入阻值較高，在對(duì)儀器內(nèi)部進(jìn)行任何零部件修理焊接時(shí)，應(yīng)使用45W以下有良好地線的烙鐵，無(wú)接地線烙鐵應(yīng)撥下電源插頭焊接。分光光度計(jì) 不同物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)入射光的吸收程度各不相同，從而形成特征性的吸收光譜。
分光光度法不僅適應(yīng)于可見(jiàn)光區(qū)，同時(shí)還可擴(kuò)展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)，因此給科研實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了極大方便。下面重點(diǎn)介紹分光光度計(jì)的使用及注意事項(xiàng)。
使用規(guī)。
2.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般有哪些注意事項(xiàng)
目前，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，分子生物學(xué)相關(guān)的理論和技術(shù)已深入到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，一些常用的技術(shù)，如基因組DNA的分離純化，質(zhì)粒DNA的抽提及純化，RNA的提取，PCR擴(kuò)增，Southern blot等成為分子生物學(xué)研究的強(qiáng)有力工具，為分子生物學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用，然后，這些實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)都涉及到氯仿、DEPC、同位素等有毒有害或具放射性的物質(zhì)，對(duì)環(huán)境和人身安全也造成巨大的威脅。因此，弄清這些有害有毒物質(zhì)的作用，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室安全管理，建立良好的制度和處理，保證分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室成為真正的科研陣地。
放射性物質(zhì)的處理：放射性同位素技術(shù)具有靈敏、簡(jiǎn)便和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用普遍，但由于放射性同位素的輻射會(huì)給人體造成損傷，如果使用不當(dāng)或操作不規(guī)范，會(huì)造成環(huán)境污染，甚至損傷人員。在進(jìn)行同位素操作時(shí)一定要注意個(gè)人防護(hù)，包括使用隔離、專(zhuān)用衣帽手套及防護(hù)背心、擋板等。對(duì)放射性同位素的污染進(jìn)行安全性教育，實(shí)行責(zé)任到人的做法，對(duì)放射性物質(zhì)統(tǒng)一保管、集中存放、集中處理的做法。在定購(gòu)?fù)凰貢r(shí)，根據(jù)需要量進(jìn)行訂購(gòu)。α-31p半衰期為14.5天，在southern blotting應(yīng)用較廣，是危害較大的放射性物質(zhì)。DNA雜交時(shí)，在探針標(biāo)記、洗膜等幾個(gè)階段都涉及同位素。對(duì)含α-31p固體廢物，放入鐵皮箱10個(gè)半衰期（約半年）后埋到指定的地點(diǎn)：對(duì)于含α-31p濃度較高的液體廢物（如首次洗膜液），在厚實(shí)的朔料桶放置8個(gè)半衰期后倒入專(zhuān)用的下水道；含α-31p濃度較低的液體廢物（如二、三次洗膜液），則直接倒入專(zhuān)用的下水道。
4.3常見(jiàn)的有毒物質(zhì)的處理：溴化乙錠、Trizol、丙烯酰氨、DEPC、甲酰氨等毒性高、環(huán)境危害大的物質(zhì)，分類(lèi)收集后統(tǒng)一處理。
4.3.1 EB(Ethidiunl bromide，溴化乙錠)：EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對(duì)于含有EB的溶液也不應(yīng)直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大干0.5μg/ml溶液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳。不時(shí)輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時(shí)，濾紙過(guò)濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。或用專(zhuān)用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過(guò)夜，再焚燒袋子即可。EB接觸物，如抹布、槍頭等埋入地下。
4.3.2 Trizol：提取組織和細(xì)胞RNA的一種重要試劑，在提取RNA時(shí)一定要在通風(fēng)進(jìn)行。如皮膚接觸Trizol，請(qǐng)立即用大量去垢劑和水沖洗，廢液埋入地下。
4.3.3 DEPC(Diethylprocarbonate，二乙基焦碳酸酯)：RNA酶的強(qiáng)抑制劑，一種潛在的致癌物質(zhì)。操作時(shí)戴口罩。在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。沾到手上立即沖洗，廢液通過(guò)廢液道排泄。
4.3.4 CHCl3(ChIoroform，氯仿)：常用于DNA和RNA提取，對(duì)皮膚、眼睛、黏膜和呼吸道有強(qiáng)烈的刺激作用和腐蝕性，易損害肝和腎。操作時(shí)戴手套在通風(fēng)櫥里進(jìn)行，廢液收集后埋入地下。
4.3.5 Acrylamide（丙烯酰胺）：DNA測(cè)序、SSR及蛋白質(zhì)分離等技術(shù)中作電泳支持物，具神經(jīng)毒性，聚合后毒性消失。操作時(shí)戴手套在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，聚合后的聚丙烯酰胺凝膠沒(méi)有毒性，可隨普通垃圾一起扔掉，千萬(wàn)不要倒入下水道。
3.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般有哪些注意事項(xiàng)
目前，分子生物學(xué)飛速發(fā)展，分子生物學(xué)相關(guān)的理論和技術(shù)已深入到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，一些常用的技術(shù)，如基因組DNA的分離純化，質(zhì)粒DNA的抽提及純化，RNA的提取，PCR擴(kuò)增，Southern blot等成為分子生物學(xué)研究的強(qiáng)有力工具，為分子生物學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用，然后，這些實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)都涉及到氯仿、DEPC、同位素等有毒有害或具放射性的物質(zhì)，對(duì)環(huán)境和人身安全也造成巨大的威脅。
因此，弄清這些有害有毒物質(zhì)的作用，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室安全管理，建立良好的制度和處理，保證分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室成為真正的科研陣地。放射性物質(zhì)的處理：放射性同位素技術(shù)具有靈敏、簡(jiǎn)便和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用普遍，但由于放射性同位素的輻射會(huì)給人體造成損傷，如果使用不當(dāng)或操作不規(guī)范，會(huì)造成環(huán)境污染，甚至損傷人員。
在進(jìn)行同位素操作時(shí)一定要注意個(gè)人防護(hù)，包括使用隔離、專(zhuān)用衣帽手套及防護(hù)背心、擋板等。對(duì)放射性同位素的污染進(jìn)行安全性教育，實(shí)行責(zé)任到人的做法，對(duì)放射性物質(zhì)統(tǒng)一保管、集中存放、集中處理的做法。
在定購(gòu)?fù)凰貢r(shí)，根據(jù)需要量進(jìn)行訂購(gòu)。α-31p半衰期為14.5天，在southern blotting應(yīng)用較廣，是危害較大的放射性物質(zhì)。
DNA雜交時(shí)，在探針標(biāo)記、洗膜等幾個(gè)階段都涉及同位素。對(duì)含α-31p固體廢物，放入鐵皮箱10個(gè)半衰期（約半年）后埋到指定的地點(diǎn)：對(duì)于含α-31p濃度較高的液體廢物（如首次洗膜液），在厚實(shí)的朔料桶放置8個(gè)半衰期后倒入專(zhuān)用的下水道；含α-31p濃度較低的液體廢物（如二、三次洗膜液），則直接倒入專(zhuān)用的下水道。
4.3常見(jiàn)的有毒物質(zhì)的處理：溴化乙錠、Trizol、丙烯酰氨、DEPC、甲酰氨等毒性高、環(huán)境危害大的物質(zhì)，分類(lèi)收集后統(tǒng)一處理。 4.3.1 EB(Ethidiunl bromide，溴化乙錠)：EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對(duì)于含有EB的溶液也不應(yīng)直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大干0.5μg/ml溶液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳。
不時(shí)輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時(shí)，濾紙過(guò)濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。或用專(zhuān)用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過(guò)夜，再焚燒袋子即可。
EB接觸物，如抹布、槍頭等埋入地下。 4.3.2 Trizol：提取組織和細(xì)胞RNA的一種重要試劑，在提取RNA時(shí)一定要在通風(fēng)進(jìn)行。
如皮膚接觸Trizol，請(qǐng)立即用大量去垢劑和水沖洗，廢液埋入地下。 4.3.3 DEPC(Diethylprocarbonate，二乙基焦碳酸酯)：RNA酶的強(qiáng)抑制劑，一種潛在的致癌物質(zhì)。
操作時(shí)戴口罩。在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
沾到手上立即沖洗，廢液通過(guò)廢液道排泄。 4.3.4 CHCl3(ChIoroform，氯仿)：常用于DNA和RNA提取，對(duì)皮膚、眼睛、黏膜和呼吸道有強(qiáng)烈的刺激作用和腐蝕性，易損害肝和腎。
操作時(shí)戴手套在通風(fēng)櫥里進(jìn)行，廢液收集后埋入地下。 4.3.5 Acrylamide（丙烯酰胺）：DNA測(cè)序、SSR及蛋白質(zhì)分離等技術(shù)中作電泳支持物，具神經(jīng)毒性，聚合后毒性消失。
操作時(shí)戴手套在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，聚合后的聚丙烯酰胺凝膠沒(méi)有毒性，可隨普通垃圾一起扔掉，千萬(wàn)不要倒入下水道。
4.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作規(guī)程
第3章 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù) 這里的實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)是指在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用范圍最廣、使用頻率最高、幾乎所有實(shí)驗(yàn)都要應(yīng)用的技術(shù)。
器皿的清洗，試管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、電子天平等量具的正確操作和使用、試劑配制等技術(shù)，應(yīng)當(dāng)都是基本操作技術(shù)，但這些內(nèi)容已在分析化學(xué)、生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)課程中作了詳細(xì)介紹。本章主要介紹與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有關(guān)的除（滅）菌技術(shù)、無(wú)菌操作技術(shù)和微量操作技術(shù)。
3.1 除（滅）菌技術(shù) 在進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要一個(gè)清潔的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，所使用的器皿及溶液均需要進(jìn)行除（滅）菌處理，一方面避免環(huán)境中微生物的污染，另一方面還可消除蛋白酶和核酸酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾和影響。在進(jìn)行微生物及細(xì)胞的純培養(yǎng)時(shí)要求更高，不能有任何外來(lái)雜菌。
因此，對(duì)所有器材、培養(yǎng)基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，對(duì)工作場(chǎng)所進(jìn)行消毒，保證工作順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室常用的除滅菌方法主要有物理方法及化學(xué)方法兩種。
物理方法包括用濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線、過(guò)濾、離心沉淀等方法除去微生物；化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺死或抑制微生物。根據(jù)被滅菌物品的材料性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求，可采取不同的消毒滅菌方法。
3.1.1 物理滅菌法 （1）干熱滅菌：干熱滅菌包括火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌?；鹧孀茻m用于金屬用具，如接種環(huán)、接種針和手術(shù)器械等，玻璃器皿的口頸，如試管口和瓶口，玻璃棒等的滅菌處理。
這種方法滅菌迅速?gòu)氐?。熱空氣滅菌一般在烤箱中進(jìn)行，利用高溫干燥空氣（160℃?170℃）加熱滅菌1?2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。
干熱消毒后的器皿干燥，易于保存。缺點(diǎn)是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要求較高的溫度和較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的。
應(yīng)當(dāng)注意，干烤滅菌完畢后不得馬上將烤箱門(mén)打開(kāi)，須等溫度降至70℃以下時(shí)再開(kāi)箱門(mén)，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。在滅菌時(shí)，物品不能放的太擠。
滅菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干熱滅菌時(shí)容易炸裂。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此方法消毒。
（2）濕熱滅菌：在相同溫度下，濕熱的滅菌效力比干熱滅菌好。原因是：（1）熱蒸汽對(duì)細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)。
水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵，更易使蛋白質(zhì)變性。加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。
蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比；（2）熱蒸汽比熱空氣穿透力強(qiáng)，能更有效地殺滅微生物；（3）蒸汽存在潛能，當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變成液體時(shí)可放出大量熱能，故可更迅速提高滅菌物體的溫度。濕熱滅菌常用的方法有高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌和煮沸滅菌。
其中高壓蒸汽滅菌法最為常用，效果最好。常壓蒸汽滅菌法不能在短時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)菌芽孢，必須采取間歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法，才能達(dá)到完全滅菌。
而煮沸滅菌僅用于注射器及某些用具的滅菌，被滅菌物品的濕度太大。所以，這兩種方法較少使用。
高壓蒸氣滅菌是在密閉的高壓蒸汽鍋中進(jìn)行的。其原理是：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，將鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱就會(huì)使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而使溫度也隨之上升到100℃以上。
滅菌時(shí)，根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時(shí)間，一般物品（如布類(lèi)、金屬器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培養(yǎng)液和橡膠制品為0.1MPa下10min。滅菌前在鍋內(nèi)加適量的水，加水過(guò)少，易將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。
加水過(guò)多有可能引起滅菌物品浸水。物品不能裝得過(guò)滿，以免影響消毒器內(nèi)氣體流通。
導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞。在加熱升壓之前，先要打開(kāi)排氣閥門(mén)排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門(mén)，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，開(kāi)始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開(kāi)始計(jì)時(shí)，并控制壓力恒定。
滅菌過(guò)程中，操作者不能離開(kāi)工作崗位，要定時(shí)檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。滅菌完畢后一定要先打開(kāi)閥門(mén)放氣，當(dāng)滅菌鍋內(nèi)壓力下降到“0”時(shí)，再打開(kāi)滅菌鍋的蓋。
也可在滅菌完畢后，關(guān)閉電源總閥，讓滅菌物品自然冷卻，待滅菌鍋壓力表降至“0”時(shí)，再取出滅菌物品。蒸汽壓力與溫度的關(guān)系 蒸汽壓力（表壓） 蒸汽溫度 Kg/cm2 MPa ℃ ℉0.00 0.00 100 2120.25 0.025 107.0 2240.50 0.050 112.0 2340.75 0.075 115.5 2401.00 0.100 121.0 2501.50 0.150 128.0 2622.00 0.200 134.5 274 (3)紫外線殺菌： 紫外線的波長(zhǎng)范圍是200?300nm，殺菌范圍為240?280nm，其中波長(zhǎng)在260nm左右的紫外線殺菌作用最強(qiáng)。
紫外燈是人工制造的低壓水銀燈，能輻射出257.3nm的紫外線，殺菌能力強(qiáng)且較穩(wěn)定。紫外線殺菌作用是因?yàn)樗梢员坏鞍踪|(zhì)（波長(zhǎng)為280nm）和核酸（波長(zhǎng)為260nm）吸收，造成這些分子的變性失活。
紫外線穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、紙張和大多數(shù)其他物體，但能穿透空氣，主要用于實(shí)驗(yàn)室空氣、操作臺(tái)表面和不能使用其它方法進(jìn)行滅菌的物品。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣。
