測定蛋白質(zhì)構象方法(測定蛋白質(zhì)的構型和功能要用什么儀器,步驟)
1.測定蛋白質(zhì)的構型和功能要用什么儀器,有哪些步驟
你好，很高興回答你的問(wèn)題。
構型這個(gè)概念是指 一個(gè)有機分子中各個(gè)原子特有的固定的空間排列。這種排列不經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵的斷裂和重新形成是不會(huì )改變的。構型的改變往往使分子的光學(xué)活性發(fā)生變化。蛋白質(zhì)的構型就是一級結構，指其氨基酸排列順序。
測定蛋白質(zhì)的構型的主要有兩種方法：Edman降解（Edman degradation）和質(zhì)譜法。
EDMAN降解法測序是經(jīng)典的方法，通過(guò)從多肽鏈游離的N末端（或者C末端，但是很少）測定氨基酸殘基的序列的過(guò)程。N末端氨基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然后從多肽鏈上切下修飾的殘基，現在一般都是自動(dòng)測序儀。
質(zhì)譜法測蛋白只要是利用生物質(zhì)譜儀，比如ESI-Q-TOF,ESI-IT-Obitraq。利用特異的酶將蛋白切成肽段， 然后通過(guò)質(zhì)譜方法進(jìn)行測定，產(chǎn)生數據或通過(guò)重頭比對，或者通過(guò)生物信息學(xué)中數據庫搜索的方法推斷出肽段序列，然后再由肽段序列拼接處蛋白序列。這種方法是近些年來(lái)隨著(zhù)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展而廣泛被使用，但是對于蛋白完整序列測定需要較強的生物信息學(xué)技術(shù)。
整體而言， EDMAN降解法準確， 但是耗時(shí)長(cháng)， 而且對于所測定的肽段要求很高， 不能太長(cháng)， 不能太難修飾等等， 一般能測個(gè)20-50堿基不錯了。而質(zhì)譜法方法快速，但是準確性比EDMAN降解法略差。
另外，樓主講的蛋白功能測定，不同的蛋白質(zhì)功能各異，蛋白功能主要通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗反復驗證次得到，這個(gè)比較復雜，沒(méi)有固定的模式，要逐一研究。
另外，像核磁儀可以用來(lái)研究蛋白的構象或者說(shuō)晶體結構，表面等離子共振儀器可以用來(lái)研究蛋白蛋白相互作用，等等，蛋白質(zhì)是未來(lái)有限的生物研究資源，現在全世界對蛋白質(zhì)的研究熱情都很高。也有許多相關(guān)的基礎科教書(shū)，樓主感興趣可以去看看。
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2.測量蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法有哪些
等電點(diǎn)：如果調節溶液的PH值使得其中的氨基酸呈電中性，我們把這個(gè)PH值稱(chēng)為氨基酸的等電點(diǎn)：PI。PI是氨基酸的重要常數之一，它的意義在于，物質(zhì)在PI處的溶解度最小，是分離純化物質(zhì)的重要手段。
等電點(diǎn)的計算：對于所有的R基團不解離的氨基酸而言（即解離只發(fā)生在α-羧基和α-氨基上），計算起來(lái)非常簡(jiǎn)單：PI=(PK1'+PK2')/2若是碰到R基團也解離的，氨基酸就有了多級解離，這個(gè)公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aa Cys Asp Glu Lys His ArgPK'α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19PK'α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04PK'-R-基團 10.78(-SH) 3.86（β-COOH） 4.25（γ- COOH） 10.53（ε-NH2） 6（咪唑基） 12.48（胍基）在這種情況下可以按下面的步驟來(lái)計算：
<1>； 由PK'值判斷解離順序，總是PK1'< PK2'< PK3'<； …，即誰(shuí)的PK'值小，誰(shuí)就先解離。
<2>； 按照解離順序正確寫(xiě)出解離方程式：簡(jiǎn)式，注意解離基團的正確寫(xiě)法。<3>； 找出呈電中性的物質(zhì)，其左右PK'值的平均值就是氨基酸的等電點(diǎn)：PI=(PK左'+PK右')/2以L(fǎng)ys為例：在黑板上用簡(jiǎn)式演示
<3>；等電點(diǎn)的測定：等電聚焦法：這是一種特殊的電泳，其載體上鋪有連續的PH梯度的緩沖液，然后將氨基酸點(diǎn)樣，只要該處的PH與氨基酸的PI不同，則氨基酸就會(huì )帶電，PH值>PI時(shí)，aa帶-電；PH值<PI時(shí)，aa帶+電。通電后，氨基酸就會(huì )移動(dòng)，直到某處的PH=PI，氨基酸才呈電中性，不再移動(dòng)，因此，可以測出PI。等電點(diǎn)沉淀所有的氨基酸均為兩性物質(zhì)，亦即它們至少含有一個(gè)酸性基（carboxyl）及一個(gè)堿性基（α-amino）。
這些可游離的團基在pH變化時(shí)，因釋出或接受質(zhì)子而可充當弱酸或弱堿，其離子化特性與其它物質(zhì)一樣遵守Henderson-Hasselbalch方程式：pH = pKa + log10 [未質(zhì)子化的形式（堿）] / [已質(zhì)子化的形式（酸）]即pH = pKa + log [A-] / [HA] 氨基酸可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）或雙極性離子（dipolar ion）及負電荷（anion）等三種，若在酸性溶液中帶正電荷，則在堿性溶液中帶負電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí)，稱(chēng)此pH值為它的pI值（等電點(diǎn)）。因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質(zhì)於等電點(diǎn)的pH值下，其溶解度最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會(huì )凝結。所以，將pH調到等電點(diǎn)的大小，則大部份的蛋白質(zhì)將會(huì )沉淀，這種現象可以應用於估算某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn).
3.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋 白質(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
4.=測定蛋白質(zhì)分子量的主要方法有哪些
知道蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成計算器 .cn/tools/mwcal/ 一般的方法： SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量 [原理] 十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， 簡(jiǎn)稱(chēng)SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實(shí)驗基礎上發(fā)展起來(lái)的一項新技術(shù)。
用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量具有快速靈便，設備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 蛋白質(zhì)的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大多數蛋白質(zhì)，主要取決于它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無(wú)關(guān)。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開(kāi)蛋白質(zhì)氫鍵和疏水鍵，并按比例地結合到這些蛋白質(zhì)分子上形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物，每克蛋白質(zhì)一般結合1.4克SDS。SDS與蛋白質(zhì)的定比結合使蛋白質(zhì)-SDS復合物均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。
在水溶液中，蛋白質(zhì)-SDS復合物具有相同的構象，近似雪茄煙形的長(cháng)橢園棒（短軸均為1.8nm，長(cháng)軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化），克服了蛋白質(zhì)間原有的形狀差異。這樣蛋白質(zhì)-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質(zhì)分子量的函數。
蛋白質(zhì)分子量與電泳遷移率間的關(guān)系可用下式表示：lgMr = K – bm 式中 Mr為分子量；K為常數；b為斜率；m為遷移率。 因此，用本法測定蛋白質(zhì)的分子量只需根據待測蛋白質(zhì)在已知分子量的標準蛋白質(zhì)的lgMr~遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。
用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質(zhì)外，均不是天然蛋白質(zhì)的完整分子量，而是組成這些蛋白質(zhì)的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構象異常，或帶有大輔基的蛋白質(zhì)不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。
對一些結構蛋白如膠原蛋白等也不適用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續系統電泳和 SDS-不連續系統電泳兩類(lèi)；按照所制成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類(lèi)。
本實(shí)驗采用SDS-不連續垂直板型操作方法。通過(guò)實(shí)驗使學(xué)生掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板式電泳的原理及技術(shù)，包括制膠、灌膠、加樣、剝膠及固定染色等，學(xué)會(huì )用這些方法測定蛋白質(zhì)分子量。
[方法與步驟] 一、加樣液的制備 1、標準蛋白質(zhì)加樣液的制備 稱(chēng)取細胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5~1mg，置小離心管（Eppendorf管）中，加入樣品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物應離心除去。沸水浴熱處理3min，冷卻備用。
2、待測蛋白質(zhì)加樣液的制備 根據待測蛋白質(zhì)樣品存在的狀況而定。（1）固體 待測蛋白樣品，如為無(wú)鹽的純蛋白質(zhì)固體制劑，加樣液的制備方法同標準蛋白質(zhì)加樣液的制備；如為含鹽的純蛋白質(zhì)固體制劑，應先加水充分溶解，對透析緩沖液透析12~16h，然后吸取0.5mL（蛋白濃度應為0.5~1mg/mL），置Eppendorf管中，并加入等體積濃樣品溶解液，沸水浴熱處理3min，冷卻備用。
（2）液體 待測蛋白樣品，如為無(wú)鹽的純蛋白質(zhì)液體制劑，則加入等體積濃樣品溶解液，然后熱處理；如為含鹽的液體制劑，則需先透析。二、凝膠的制備1、凝膠板的準備 （1）洗板 將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗玻板，然后用自來(lái)水洗凈，再用酒精將板擦干。
（2）安裝制膠板 制膠前將玻板與塑料嵌條和凹型陶瓷板的邊緣對齊，下沿用密封膠帶封口，用塑料夾子或鐵夾子將兩端夾好，注意要確保密封，安放在固定架上。2、分離膠和濃縮膠溶液的配制 組 分 分離膠/mL 濃縮膠/mL 凝膠貯備液 2.5 0.26 分離膠緩沖液（pH8.8） 1.9 — 濃縮膠緩沖液（pH6.8） — 0.510%SDS 0.075 0.02 TEMED 0.026 0.02 雙蒸水 3.05 1.2210%過(guò)硫酸銨 0.013 0.02 總體積 7.6 2 注意：①最后加入10%過(guò)硫酸銨溶液，混合制成凝膠液，迅速灌制凝膠。
②丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無(wú)毒。
3、制分離膠 將制膠板垂直放好，插上與相應厚度的樣品梳，在梳子下緣線(xiàn)1cm處做標記，卸下樣品梳。將配好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，直至液面達到標記處。
用滴管貼近膠液界面小心而又緩慢地覆蓋厚度約0.5cm的正丁醇層，以防止溶液蒸發(fā)并保證膠面平整。4、制濃縮膠 分離膠聚合后，倒去正丁醇，用蒸餾水沖洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液。
用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿(mǎn)制膠板，插入樣品梳。（三）電泳1、安裝電泳槽 濃縮膠聚合后，除去梳子、密封膠帶以及六個(gè)鐵夾。
將制膠扳、電泳糟內芯、另一對制膠板依次放入槽內。兩制膠板的凹型陶瓷板均應與電泳槽內芯接觸。
然后插入楔型板以固定兩套制膠板。如果每次電泳只用一塊膠板，必須用提供的有機玻璃板代替另一套制膠板。
2、加樣 在內外水槽加注緩沖液，使內外槽的水位均超過(guò)凹形板的缺口但低于。
