確定酶的純化方法(酶的分離和純化方法是什么)

1.酶的分離和純化方法是什么

酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞“目的酶”的限度內(nèi)，使用各種手段；酶與底物和抑制劑的結(jié)合常使其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性發(fā)生改變，這種特性已被用于酶的分離純化。

由于酶及其來(lái)源的多樣性及與之共存的高分子物質(zhì)的復(fù)雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用于一切酶的純化。為了使一種酶達(dá)到高度純化，往往需要多種方法協(xié)同作用，通過(guò)酶活性的跟蹤檢測(cè)確定最佳流程。

擴(kuò)展資料：

酶的本性是蛋白質(zhì)，凡可用于蛋白質(zhì)分離純化的方法都同樣適用于酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫（4℃）、溫和pH(4<pH>10)等條件下進(jìn)行。

與蛋白質(zhì)類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機(jī)溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱是分離純化。

參考資料來(lái)源：百度百科——酶分離純化方法

2.酶的純化有哪些方法

酶是蛋白質(zhì)，因此凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化，如鹽析法、聚乙二醇沉淀法、有機(jī)浴劑分級(jí)沉淀法、等電點(diǎn)法、選擇性沉淀法、各種柱層析法（吸附層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾）、各種電泳法及親和層析等。

不同之處是酶的純化過(guò)程尚需選用迅速簡(jiǎn)便的活力測(cè)定方法，以追蹤酶的去向。在選用酶的活力測(cè)定方法時(shí)，分析方法的迅速要比其精確度更為重要。

如寧可要一個(gè)需時(shí)5min，準(zhǔn)確度為5%的方法；也不要一個(gè)需時(shí)30 min，準(zhǔn)確度為0.5%的方法。在建立活力測(cè)定法之后，再根據(jù)各單元純化步驟及活力分布情況用列表形式表達(dá)，表的內(nèi)容包括：操作步驟、總體積、酶濃度（每毫升酶活力）、總活力、蛋白質(zhì)濃度mg/ml）、比活力（即純度、酶活力單位/毫克蛋白）、產(chǎn)率%（每步總活力除以第一步的總活力）和純化倍數(shù)（每步比活力除以第一步比活力）。

3.酶進(jìn)行提純的方法是什么

酶，從動(dòng)植物細(xì)胞和微生物中提取之后，往往不能直接應(yīng)用，這是因?yàn)樯镌诤铣擅傅耐瑫r(shí)也合成其他大分子物質(zhì)。而這些大分子物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重干擾酶的作用，因此必須把酶從中分離出來(lái)。如果酶不純，那么極有可能在應(yīng)用中形成幾個(gè)生化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，結(jié)果得到的產(chǎn)物也就不是單一的。當(dāng)然，酶并不是越純?cè)胶谩２煌纳锘瘜W(xué)反應(yīng)，對(duì)酶的純度要求也不一樣。因此，要把酶制成不同的酶制劑，以便適應(yīng)各種需求。

要對(duì)酶進(jìn)行分離和提純，有多種方法。當(dāng)酶從生物細(xì)胞以及微生物中產(chǎn)生之后，可能留在細(xì)胞內(nèi)，也可能分泌到細(xì)胞外面。如果是胞外酶，這就方便多了，只要收集微生物和細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行分離和提純就可以了。如果酶在細(xì)胞內(nèi)（稱胞內(nèi)酶），則必須研碎細(xì)胞，才能把酶提取出來(lái)。不論是胞外酶還是胞內(nèi)酶，都可能會(huì)含有一些其他大分子物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)和淀粉之類的東西。

對(duì)付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。對(duì)于淀粉也比較好辦。最難對(duì)付的是蛋白質(zhì)，因?yàn)槊敢彩堑鞍踪|(zhì)，能破壞蛋白質(zhì)的方法也可以破壞酶，所以提純是件比較困難的事。但隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，經(jīng)過(guò)研究，已找到沉淀法、分子過(guò)濾法等。采用以上提純方法，就可以得到不同純度的酶，這為酶的廣泛應(yīng)用打開了方便之門。

4.提取酶的方法有哪些

酶是蛋白質(zhì)，可以根據(jù)其特點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)提取純化方法！選擇材料及預(yù)處理 以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。

蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來(lái)同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。

在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。

微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。

植物材料必須經(jīng)過(guò)去殼，脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。

另外，對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。蛋白質(zhì)的分離純化 一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法 稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。

一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。

為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值 蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度 稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。

升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機(jī)溶劑提取法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。

丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%,40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。

由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。 影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。

一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。

（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。

因此在鹽析前血清要加。

5.酶分離純化主要包括哪些步驟,其目的分別是什么

這是一門很深的學(xué)問，除了需要高科技還需要科研專用設(shè)備，只是簡(jiǎn)介，希望對(duì)你有幫助，不要上當(dāng)受騙：酶的分離純化方法簡(jiǎn)介 生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。

這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過(guò)程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。

酶的來(lái)源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。

因此，在提取某一種酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。

目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來(lái)獲得大量的酶制劑。從微生物中來(lái)生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有很多，既不受氣候地理?xiàng)l件限制，而且動(dòng)植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過(guò)選育菌種來(lái)提高產(chǎn)量，用廉價(jià)原料可以大量生產(chǎn)。

由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時(shí)，必須經(jīng)過(guò)分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過(guò)程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。

在提純的過(guò)程中通過(guò)測(cè)定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過(guò)程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個(gè)酶的分離純化過(guò)程中的每一步驟，始終要測(cè)定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過(guò)某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。

酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。

下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)1.細(xì)胞破碎（celldisruption） 高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。

菌懸液一次通過(guò)均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。

要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過(guò)均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。

但有人報(bào)道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175mpa時(shí)，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過(guò)70mpa時(shí)，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。

高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會(huì)堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時(shí)更是如此。

在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價(jià)格便宜，常用來(lái)裂解細(xì)胞。

具體做法是：溶壁微球菌（）43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過(guò)氧化氫酶1500g。2.離心 離心分離過(guò)程可分為離心過(guò)濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過(guò)濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。

過(guò)濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過(guò)濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場(chǎng)合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過(guò)的蛋白質(zhì)等。

分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境。

現(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個(gè)步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動(dòng)環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤(rùn)滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過(guò)程中排出的廢物對(duì)環(huán)境的污染。

該離心機(jī)又如一個(gè)密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對(duì)懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對(duì)于生物制品是非常重要的。如btpx205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的。

6.酶分離純化的主要技術(shù)措施有哪些

酶是蛋白質(zhì)，因此一般蛋白質(zhì)的分離原則都應(yīng)該遵行。

但酶作為特殊的蛋白質(zhì)，最重要的原則是一定在純化過(guò)程中保持酶的活性，所以純化過(guò)程中一般要注意保持低溫、緩沖液配方避免酶的抑制。每個(gè)步驟都要檢測(cè)酶活性，一方面直觀了解純化的回收率，另一方面可以計(jì)算酶的純度。

酶的分離純化方法一般根據(jù)酶的分子量、等電點(diǎn)、疏水性等生化性質(zhì)，選擇相應(yīng)的沉淀、鹽析、層析方法，其中親和層析可以應(yīng)用可逆性底物作為配基或特異性抗體，制備親和層析膠。酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來(lái)或者將雜蛋白從酶溶液中除去。

現(xiàn)有的酶分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。 1、根據(jù)分子大小而設(shè)計(jì)的方法，如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過(guò)濾法等。

2、根據(jù)溶解度的大小分離的方法，如鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，共沉淀法。