文庫構建方法(cDNA文庫的構建方法)
1.cDNA 文庫的構建有哪些方法
cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定），要構建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無(wú) RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時(shí)包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復反應），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強調的是對載體的選擇，常規用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來(lái)構建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。
2.基因文庫構建的過(guò)程、原理及方法
1 cDNA 文庫的構建 1.1 cDNA 文庫構建的基本原理與方法 cDNA 文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
經(jīng)典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定），要構建一個(gè)高質(zhì)量的 cDNA 文庫，獲得高質(zhì)量的 mRNA 是至關(guān)重要的，所以處理 mRNA 樣品時(shí)必須仔細小心。
由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個(gè)無(wú) RNA 酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA 很重要。在獲得高質(zhì)量的 mRNA 后，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成（用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時(shí)包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進(jìn)行的修復反應），合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進(jìn)行鑒定。
這里強調的是對載體的選擇，常規用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來(lái)構建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長(cháng)文庫 經(jīng)典 cDNA 文庫的構建雖然高效、簡(jiǎn)便，但文庫克隆的片段一般較小，單個(gè)克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個(gè)克隆才能覆蓋一個(gè)完整的全基因的 cDNA。
為了克隆到真正的 cDNA 全長(cháng)，建立富含全長(cháng)的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點(diǎn)所導致的局限性。
全長(cháng) cDNA 文庫，是指從生物體內一套完整的 mRNA 分子經(jīng)反轉錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個(gè)完整的拷貝。全長(cháng) cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過(guò)基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預測及進(jìn)行體外表達和通過(guò)反向遺傳學(xué)研究基因的功能等。
目前所報道的對全長(cháng)文庫的構建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 （Invitrogen,USA） 使用說(shuō)明進(jìn)行。判斷一個(gè) cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長(cháng)基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價(jià) 5'端：如果有同源全長(cháng)基因的比較，可以通過(guò)與其它生物已知的對應基因5'末端進(jìn)行比較來(lái)判斷。如果無(wú)同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開(kāi)放閱讀框的第1個(gè) ATG 上游有無(wú)同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點(diǎn)，一般加在5'帽結構后有一段富含嘧啶的區域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經(jīng)過(guò)酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。
3'端：同樣可以用其它生物已知的對應基因3'末端進(jìn)行比較來(lái)判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個(gè)以上的 PolyA 加尾信號，或無(wú)明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實(shí)驗方法證實(shí) 可以通過(guò)引物延伸法確定5'端和3'端的長(cháng)度，如：5'端 RACE,3'端 RACE，或者通過(guò) Northern Blot 證實(shí)大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質(zhì)量的評價(jià)主要有兩個(gè)方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來(lái)源細胞中表達信息（即 mRNA 種類(lèi)）的完整性，它是體現文庫質(zhì)量的最重要指標。
文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來(lái)衡量，它是指構建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數。庫容量取決于來(lái)源細胞中表達出的 mRNA 種類(lèi)和每種 mRNA 序列的拷貝數，1個(gè)正常細胞含10000~30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數群中所占比例少于0.5%時(shí)。
滿(mǎn)足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算（ P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設為99%;N 為文庫中以 P 概率出現細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應具有的最少重組子克隆數；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數；T 為細胞中表達出的所有 mRNA 的總拷貝數）。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。
在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區，中間的編碼區和3'端非翻譯區。
非翻譯區的序列特征對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產(chǎn)物—蛋白質(zhì)模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長(cháng)以便盡可能地反應出天然基因的結構。
2 cDNA 文庫構建的其它類(lèi)型 2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因對應的 cDNA 的拷貝數相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過(guò)基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進(jìn)行。
3.如何建立自己的文庫
文庫不需要建立，你注冊了百度帳號，就有自己的文庫了。
登錄百度知道后，在頁(yè)面上方點(diǎn)“文庫”，再在右上角點(diǎn)“個(gè)人文庫”，然后點(diǎn)“我的貢獻”，就進(jìn)入你的文庫了。
在你的文庫里，可以看到你的文庫積分，以及你上傳或下載的文檔。
現在百度文檔可以復制，也可以免費收藏了。
復制方法：
打開(kāi)百度文庫，用關(guān)鍵詞搜索你要的文檔。
找到文檔后，用鼠標把文檔的文字拉變色，然后松開(kāi)鼠標，就能看到“復制”、“分享”，這兩個(gè)按扭了。
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找到文檔后，打開(kāi)文檔，在文檔的下面有“收藏此文檔”和“下載”兩個(gè)按扭
你點(diǎn)“收藏此文檔”，就可以把文檔收藏到你的文庫里了。
下載方法：
如果你文庫財富值足夠，去百度文庫搜索你想要的文檔直接下載就行了。
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4.百度文庫如何建立
百度文庫“文檔專(zhuān)輯”功能 點(diǎn)擊創(chuàng )建文輯，填標題、介紹、分類(lèi)，關(guān)鍵詞方便用戶(hù)在使用時(shí)候更快更好地找到自己想看和喜歡看的文檔。
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創(chuàng )建文檔專(zhuān)輯 用戶(hù)在進(jìn)入文庫首頁(yè)的某個(gè)分類(lèi)后會(huì )看到分類(lèi)下有文檔和文輯兩個(gè)選項卡，點(diǎn)擊文輯的選項卡后，會(huì )看到右上角有一個(gè)創(chuàng )建文輯的按鈕。 點(diǎn)擊創(chuàng )建文輯后，填寫(xiě)文輯的標題、介紹、分類(lèi)，然后為你的文輯填寫(xiě)幾個(gè)關(guān)鍵詞（非必填項）。
文輯標題最好是能概括文輯中的文檔內容，字數太少或太沒(méi)有明確的意義的話(huà)可能不利于文輯發(fā)揮作用。文輯的介紹是對這個(gè)文輯的一段介紹性的語(yǔ)句，方便讓其他的用戶(hù)更了解此文輯要傳達的意思。
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