pcr檢測(PCR實(shí)驗操作注意事項有哪些)
1.PCR實(shí)驗操作注意事項有哪些
1、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測人員必須通過(guò)國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓并取得合格證書(shū)；
3、必須擁有標準的的PCR熒光實(shí)驗室；
4、后PCR區PCR完成以后，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。
擴展資料
PCR實(shí)驗特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗產(chǎn)物的生成量是以指數方式增加的，能從100萬(wàn)個(gè)細胞中檢出一個(gè)靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個(gè)RFU；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細菌。
2、簡(jiǎn)便、快速：PCR實(shí)驗反應一般在2~4 小時(shí)完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。
參考資料來(lái)源：百度百科-PCR實(shí)驗室
2.PCR的操作注意事項
PCR操作注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì )與RNA一同沉淀出來(lái)，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺式離心機，2600*g離心30-60分鐘。
預期產(chǎn)量：1mg組織或1*106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤(pán)1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg
3.在PCR擴增實(shí)驗中應注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為48h以?xún)龋行┳詈糜诋斎针娪緳z測，大于48h后帶型不規則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。
需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。
有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。 假陽(yáng)性 出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。
需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假陽(yáng)性。
這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現非特異性擴增帶 PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。
其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。
降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。
其對策有：減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。
4.RT
在做Northern等雜交實(shí)驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時(shí)，會(huì )用到RNA提取和RT-PCR技術(shù)。
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱(chēng)為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開(kāi)的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經(jīng)過(guò)剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA里面會(huì )含有非編碼區。要表達真核生物的基因并表達出相應的蛋白，只能通過(guò)提取其mRNA并RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1.RNA的提取 RNA的提取其實(shí)原理很簡(jiǎn)單：通過(guò)變性劑破碎細胞或者組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過(guò)沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無(wú)處不在，隨時(shí)可能將RNA降解，所以實(shí)驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會(huì )前功盡棄。
1.1 分離高質(zhì)量RNA 成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應保證全長(cháng)并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。
RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。
另外，分離poly(A)+RNA會(huì )導致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當分析稀有mRNA時(shí)，poly(A)+RNA會(huì )增加檢測的靈敏度。
1.2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶 在所有RNA實(shí)驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(cháng)的RNA。而實(shí)驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì )引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實(shí)驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。
在其它分子生物學(xué)實(shí)驗中使用的RNA酶也會(huì )造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。
而各種組織和細胞中則含有大量?jì)仍葱缘腞NA酶。 1.3 常用的RNA酶抑制劑 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。
它通過(guò)和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 *異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。
它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對RNA酶有強烈的變性作用。 *氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 1.4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準備的工作 *盡可能在實(shí)驗室專(zhuān)門(mén)辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專(zhuān)用。
RNA操作區應保持清潔，并定期進(jìn)行除菌。 *操作過(guò)程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。
盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來(lái)不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNase H、T1等，在操作過(guò)程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。
而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。 *關(guān)于一次性塑料制品，建議使用廠(chǎng)家供應的出廠(chǎng)前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。
多數廠(chǎng)家供應的無(wú)菌塑料制品很少有RNase污染，買(mǎi)來(lái)后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導致實(shí)驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(cháng)時(shí)間。 *無(wú)法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。
*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應采用未開(kāi)封的新瓶裝試劑。 *塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。 *配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理。
5.在PCR擴增實(shí)驗中應注意什么
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過(guò)長(cháng)或過(guò)短均會(huì )使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒(méi)有嚴格的限制，故引物設計時(shí)可在5'末端加上限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過(guò)低會(huì )影響反應產(chǎn)量，過(guò)高會(huì )增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無(wú)3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無(wú)校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。
Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng )出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為T(mén)aq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數據來(lái)源：美國冷泉港實(shí)驗室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過(guò)量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過(guò)高會(huì )增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過(guò)低則會(huì )導致反應速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長(cháng)度，通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。
在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。6. 減低污染的常規措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開(kāi)放置；②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區的獨立性；③使用陽(yáng)性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗的所有反應試劑；⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗前一定要認真清潔加樣器等。
