細(xì)胞復(fù)蘇步驟和(細(xì)胞凍存與復(fù)蘇步驟 原理及注意事項(xiàng))

1.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇步驟、原理及注意事項(xiàng)

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培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇? 概述 |? 凍存過程 |

? 冷凍保存與復(fù)蘇的原理 |? 凍存結(jié)果 |

? 冷凍速率 |? 討論 |

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? 主要材料 |? 討論 |

? 凍存過程 |? 玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 |

? 凍存結(jié)果 |? 主要材料 |

? 討論 |? 復(fù)蘇過程 |

? 玻璃化凍存方法 |? 結(jié)果 |

? 主要材料 |? 討論 |

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Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對(duì)低溫下貯存的細(xì)胞具有保護(hù)作用，他們?nèi)匀灰跃舆M(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，加入甘油能夠大大提高貯存于-790C下精子的存活率。接下來的重大進(jìn)展是Luyet(1951)與Lovelock(1953)等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)貯存細(xì)胞的損傷作用。他們的結(jié)論是，電解質(zhì)濃度增大是造成貯存細(xì)胞損傷的主要原因。冷凍理論后來得到Merryman(1956)、Rey(1957)以及在不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的

2.和注意事項(xiàng)細(xì)胞復(fù)蘇如何進(jìn)行,有哪些需要注意的事

一、\x09復(fù)蘇

1.\x09把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng).液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺(tái)里.

2.\x09把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘.

3.\x09把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來.吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布.

4.\x09標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基.

5.\x093天換一次培養(yǎng)基.

二、\x09傳代

1.\x09培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代.

2.\x09把原有培養(yǎng)基吸掉.

3.\x09加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-2分鐘.

4.\x09細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化.

5.\x09用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來.

6.\x09把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘.

7.\x09倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來.

8.\x09根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中.一般，癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè).繼續(xù)培養(yǎng).

三、\x09 凍存

把細(xì)胞消化下來并離心（同上）.用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細(xì)胞種類，凍存日期.4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存.

凍存液的配制：70%的完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖.

要注意的就是無菌操作！

3.求細(xì)胞復(fù)蘇方法步驟和注意事項(xiàng)

博凌科為解答：【材料】1.常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)儀器設(shè)備 恒溫水浴振蕩器。

2.培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）【操作程序】1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。2.培養(yǎng)液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預(yù)熱20min，備用。

3.二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，備用。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。

5.將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min,5min）。6.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.記錄復(fù)蘇日期。【注意事項(xiàng)】1.取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。

此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。

如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。

細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。4.離心問題：目前主要有兩種見解。

一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大， 死亡。

此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。

我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。5.細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml-15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

6.復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響 細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個(gè)說法是1%。

所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

4.細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇要注意什么 – 手機(jī)愛問

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇步驟注意事項(xiàng)一、原理在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。

如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。

貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的-5~0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。二、操作步驟（一）凍存1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5*106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。5、將凍存管口封嚴(yán)。

如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。

凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（-30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，絕對(duì)不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1~1.5月。

（二）復(fù)蘇1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。2. 培養(yǎng)液（DMEM）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預(yù)熱20min，備用。

3. 二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min，備用。4. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。

5. 將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min,5min）。6. 用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 記錄復(fù)蘇日期?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。

此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2. 凍存液的問題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。

如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。

細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。4. 離心問題：目前主要有兩種見解。

一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大， 死亡。

此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。

我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。5. 細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml-15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。7. 加培養(yǎng)基的量放入問題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響 細(xì)胞生長(zhǎng)，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個(gè)說法是1%。

所以如果你的凍存液的濃度是 10%DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

5.心肺復(fù)蘇基本步驟和注意事項(xiàng)

樓主你好；

心肺復(fù)蘇ABC步驟；

A 開放氣道

拍搖患者并大聲詢問，手指甲掐壓人中穴約五秒，如無反應(yīng)表示意識(shí)喪失。這時(shí)應(yīng)使患者水平仰臥，解開頸部鈕扣，注意清除口腔異物，使患者仰頭抬頦，用耳貼近口鼻，如未感到有氣流或胸部無起伏，則表示已無呼吸。

B 口對(duì)口人工 呼吸

在保持患者仰頭抬頦前提下，施救者用一手捏閉的鼻孔 （或口唇 ），然后深吸一大口氣，迅速用力向患者口 （或鼻 ）內(nèi)吹 氣 ， 然后放松鼻孔（或口唇），照此每5秒鐘反復(fù)一次，直到恢復(fù)自主呼吸。

每次吹氣間隔1.5秒，在這個(gè)時(shí)間搶救者應(yīng)自己深呼吸一次，以便繼續(xù)口對(duì)口呼吸，直至專業(yè)搶救人員的到來。

C 人工循環(huán)

檢查心臟是否跳動(dòng)，最簡(jiǎn)易、最可靠的是頸動(dòng)脈。搶救者用2-3個(gè)手指放在患者氣管與頸部肌肉間輕輕按壓，時(shí)間不少于10秒。

如患者停止心跳，搶救者應(yīng)握緊拳頭，拳眼向上，快速有力猛擊患者胸骨正中下段一次。此舉有可能使患者心臟復(fù)跳，如一次不成功可按上述要求再次扣擊一次。

如心臟不能復(fù)跳，就要通過胸外按壓，使心臟和大血管血液產(chǎn)生流動(dòng)。以維持心、腦等主要器官最低血液需要量。

選擇胸外心臟按壓部位：先以右手的中指、示指定出肋骨下緣，而后將右手掌側(cè)放在胸骨下1/3，再將左手放在胸骨上方，左手拇指鄰近右手指，使左手掌底部在劍突上。右手置于左手上，手指間互相交錯(cuò)或伸展。按壓力量經(jīng)手跟而向下，手指應(yīng)抬離胸部。

·胸外心臟按壓方法：急救者兩臂位于病人胸骨的正上方，雙肘關(guān)節(jié)伸直，利用上身重量垂直下壓，對(duì)中等體重的成人下壓深度為3—4厘米，而后迅速放松，解除壓力，讓胸廓自行復(fù)位。如此有節(jié)奏地反復(fù)進(jìn)行，按壓與放松時(shí)間大致相等，頻率為每分鐘80—100次。

一人心肺復(fù)蘇方法：當(dāng)只有一個(gè)急救者給病人進(jìn)行心肺復(fù)蘇術(shù)時(shí)，應(yīng)是每做30次胸心臟按壓，交替行2次人工呼吸。

二人心肺復(fù)蘇方法：當(dāng)有兩個(gè)急救者給病人進(jìn)行心肺復(fù)蘇術(shù)時(shí)，首先兩個(gè)人應(yīng)呈對(duì)產(chǎn)位置，以便于互相交換。此時(shí)，一個(gè)人做胸外心臟按壓；另一個(gè)人做人工呼吸。兩人可以數(shù)著1、2、3進(jìn)行配合，每按壓心臟30次，口對(duì)口或口對(duì)鼻人工呼吸2次。）

注意事項(xiàng) ；

1、口對(duì)口吹氣量不宜過大，一般不超過1200毫升，胸廓稍起伏即可。吹氣時(shí)間不宜過長(zhǎng)，過長(zhǎng)會(huì)引起急性胃擴(kuò)張、胃脹氣和嘔吐。吹氣過程要注意觀察患（傷）者氣道是否通暢，胸廓是否被吹起。

2、胸外心臟按術(shù)只能在患（傷）者心臟停止跳動(dòng)下才能施行。

3、口對(duì)口吹氣和胸外心臟按壓應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，嚴(yán)格按吹氣和按壓的比例操作，吹氣和按壓的次數(shù)過多和過少均會(huì)影響復(fù)蘇的成敗。

4、胸外心臟按壓的位置必須準(zhǔn)確。不準(zhǔn)確容易損傷其他臟器。按壓的力度要適宜，過大過猛容易使胸骨骨折，引起氣胸血胸；按壓的力度過輕，胸腔壓力小，不足以推動(dòng)血液循環(huán)。

5、施行心肺復(fù)蘇術(shù)時(shí)應(yīng)將患（傷）者的衣扣及褲帶解松，以免引起內(nèi)臟損傷。

2005年底美國(guó)心臟學(xué)會(huì)（AHA）發(fā)布了新版CPR急救指南，與舊版指南相比，主要就是按壓與呼吸的頻次由15:2調(diào)整為30:2

6.A549細(xì)胞的復(fù)蘇方法

1.先從液氮罐內(nèi)迅速拿出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，迅速放入37攝氏度的水浴中，并不停的搖晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染細(xì)胞；

2.將盛入37攝氏度水浴中的細(xì)胞連同燒杯一起帶入細(xì)胞房，待細(xì)胞均勻融化后，拿出；

3.將細(xì)胞懸液倒入離心管，加入3-4滴完全培養(yǎng)基，放入離心機(jī)中離心1500轉(zhuǎn)（調(diào)兩檔），3-4min，觀察細(xì)胞沉淀情況，如果太少，再次離心3-4min;

4.將離心管拿出，倒掉上清液，在離心管中加入2滴培養(yǎng)液，并用彎頭滴管伸入液面以下不斷吹打（注意不要將彎頭伸出液面，以防有氣泡產(chǎn)生，影響細(xì)胞生長(zhǎng)）；

5.將新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入兩滴管培養(yǎng)液，再將離心管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶（以防加入時(shí)產(chǎn)生氣泡）并使細(xì)胞散步均勻；

6.用酒精擦拭瓶身，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)（有透明的圓的細(xì)胞漂浮其中），培養(yǎng)瓶上寫明日期及培養(yǎng)細(xì)胞的名稱；

7.將培養(yǎng)瓶的蓋子稍松，放入CO2培養(yǎng)（便于CO2進(jìn)入）待第二天觀察（細(xì)胞一般4小時(shí)貼壁）；