植物遺傳轉化的(植物體雜交注意事項)
1.植物體雜交注意事項
植物體細胞雜交（plant somatic hybridization），又稱原生質體融合（Protoplast fusion ）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質體融合。
說道植物細胞融合，它和動物細胞融合還是有很大差別的。
第一，前者因為有細胞壁，對融合有負面影響，首先要除壁變成原生質體，可以用纖維素酶和果膠酶除壁。
第二，后者除了要加必要的營養(yǎng)物質外，還要加血清保持環(huán)境穩(wěn)定。
細胞融合方法主要有化學、生物和物理方法。一般學生實驗室使用PEG（主要含有聚乙二醇）法融合。其優(yōu)點是操作簡單不需要特殊的設備。只需在去壁的細胞加入適量的PEG處理適當?shù)臅r間，然后終止PEG的作用，然后在普通光學顯微鏡即可看到融合細胞。這種方法也有缺點，如不好控制PEG作用的時間，而且PEG對細胞也可能有害。
只有處理時間得當，細胞壁去除了才可能提高成活率。
優(yōu)點：植物體細胞雜交是兩種異源原生質體，在誘導劑誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞，進一步發(fā)育成雜種植物體。通過細胞融合技術可以克服種、屬以上職務有性雜交不親和障礙，為廣泛重組遺傳物質開辟了新途徑，也為攜帶外源遺傳物質（信息）的大分子滲入細胞創(chuàng)造了條件，從而更進一步擴大了遺傳物質的重組范圍。
2.農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化過程中為什么必須要誘導植物regeneration
幾種常用的植物轉基因方法
遺傳轉化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)再生植株可分成兩大類，第一類據(jù)要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。
1農(nóng)桿菌介導轉化法
農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙于葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠瘓瘤或發(fā)狀根。根想農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株。 農(nóng)桿菌介導法起初只被用于雙于葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。
2基因槍介導轉化法
利用火爆炸或高壓氣體加速（這一加速設備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的
DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然后通過細腦和組織培養(yǎng)技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。與農(nóng)桿菌轉化相比，基因槍法轉化的一個主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質粒的構建也相對簡單，因此也是目前轉基因研究中應用較為廣泛的一種方法。
3花粉管通道法
在授粉后向于房含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體。該方法于印年代初期由我國學者周光字提出，我國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。
3.植物染色體標本的制備的注意事項
植物染色體制片技術是植物細胞遺傳學、染色體工程、植物細胞生物學、植物細胞分類學和物種生物學等眾多學科的基本實驗技術。植物染色體的研究由于和植物遺傳育種工作的結合而獲得良好的發(fā)展。因此，植物染色體的技術在這些研究工作中具有特別重要的意義[1-3]。Belling(1921)提出染色體壓片技術后，植物壓片已成為植物染色體研究中廣泛應用的常規(guī)技術[1]。但是由于植物細胞有很堅實的細胞壁，染色體很難像動物染色體那樣平整地貼在載玻片上。陳瑞陽（1982）提出了植物染色體標本制備的酶解去壁低滲法。本文以韭蘭為材料，對植物染色體常規(guī)壓片，去壁低滲法制片技術、染色效果進行了比較，以期在不同的材料及條件下選擇適宜的染色體制片技術，從而獲得較好的效果。
1 材料與方法
1.1 供試材料 試驗用植株由校園內(nèi)采集。
1.2 根尖制片
1.2.1 常規(guī)壓片 通常是在早上9-10點采集蔥蘭的根然后在室溫下放入0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h。然后就在常溫把材料放在卡諾氏固定液下固定10m，接下來就在1 mol/L鹽酸溶液中解離到松軟剛合適為止。最后是用蒸餾水將蔥蘭根沖洗干凈，這樣前處理就結束。處理完后就可以用醋酸洋紅染色或改良苯酚品紅染色[4]。壓片/涂片后選取典型的染色體，在40倍物鏡及油鏡下顯微照相。
1.2.2 去壁低滲法 去壁低滲法也是把材料放0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h。然后前低滲即是將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中，在20~25℃條件下處理0.5h。接下來就是最關鍵的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25~30℃溫度下處理2~5 h左右。去壁后要進行后低滲，使細胞完全脹，即是用20~30℃蒸餾水慢慢沖洗2~3次后，再將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中處理。
4.試述農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉化中外植體培養(yǎng)主要有哪些階段
1.種子消毒
成熟的水稻（Rice）種子去殼后放入無菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，無菌水沖洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其間需經(jīng)常搖動，再用無菌水洗3-4次，用無菌濾紙吸干多余的水分，將種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿約30粒，于28℃暗培養(yǎng)。
2.繼代培養(yǎng)
經(jīng)過近1月的誘導，水稻（Rice）長出黃色膨大的愈傷組織，去其盾片，將愈傷轉至新鮮的愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上進行繼代。每2周繼代一次，一般繼代2-4次即可獲得適合轉基因的嫩黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織。在繼代培養(yǎng)2周后，挑選胚性顆粒用于遺傳轉化。
3.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
在轉化平板上挑取單菌落在1ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在50ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基（含相應抗生素（antibiotic））中加入1ml上述培養(yǎng)物，200rpm,28℃培養(yǎng)5-6hr至OD600為0.6-1.0，培養(yǎng)結束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，終濃度100uM）。取上述菌液在室溫下，4000rpm,10min，棄上清，加入MS液體培養(yǎng)基（含AS 100uM）重懸菌體，在與上相同的條件下培養(yǎng)2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此時可用來轉化愈傷組織。
4.共培養(yǎng)
將水稻（Rice）胚性愈傷組織浸入農(nóng)桿菌菌液20-30min，再用無菌吸水紙吸干水分，將侵染的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培養(yǎng)三天。
5.洗菌
共培養(yǎng)的愈傷組織先用無菌水沖洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液體培養(yǎng)基中20-30min后，將愈傷組織轉入無菌濾紙上吸干。
6.選擇培養(yǎng)
將吸干水分的愈傷組織接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑選新長出的愈傷接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再選擇3周。
5.分化培養(yǎng)
將經(jīng)過2次選擇得到的抗性愈傷組織轉入到預分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麥芽糖30g/L）上暗培養(yǎng)10天左右，再轉到分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麥芽糖30 g/L）上光照培養(yǎng)。
7.生根培養(yǎng)
約1-2個月，將2cm左右高的幼苗轉到生根培養(yǎng)基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上誘導不定根的發(fā)生。
8.轉基因苗的移栽
當幼苗長至10cm高時，將幼苗取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
