病毒的分離培養方法(病毒的培養方法)

1.病毒的培養方法有哪些

病毒的培養方法： （1）動(dòng)物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進(jìn)入易感動(dòng)物的體內后可大量增殖，并使動(dòng)物產(chǎn)生特定的反應。

優(yōu)點(diǎn)：操作方面易行。缺點(diǎn)：受機體免疫力的影響，常需要用無(wú)菌動(dòng)物。

運用：分離、增殖病毒，疫苗效力試驗，疫苗和抗血清的生產(chǎn)。 （2）雞胚培養：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內，羊膜腔，尿囊腔等部位。

病毒生長(cháng)的標志為雞胚死亡、畸型和出血。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。

（3）組織培養：在離體活細胞上培養病毒的方法 1）組織塊培養：取組織片（如一段胎兒氣管或一小塊鼻黏膜）進(jìn)行培養。 2）細胞培養：病毒感染細胞后，大多數引起細胞病變，稱(chēng)為病毒的致細胞病變作用。

表現為細胞變形，胞漿內出現顆粒化，核濃縮、核裂解等。

2.目前病毒分離培養的主要方法是哪一種

1.動(dòng)物接種

這是最原始的病毒培養方法。常用的動(dòng)物有小鼠、大鼠、豚鼠百、兔和猴等，接種的途徑有鼻內、皮下、皮內、腦內、腹腔內、靜脈等。根據病毒種類(lèi)不同，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位。

2.雞胚接種雞胚對多種病度毒敏感。根據病毒種類(lèi)不同，可將標本接種于雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜上。

3.組織培養

將離體活組織塊或分散的活細胞加回以培養，統稱(chēng)為組織培養。組織培養法有三種基本類(lèi)型：器官培養、移植培養和細胞培養。細胞培養最常答用于培養病毒，根據細胞的來(lái)源，染色體特性及傳代次數又可分為下列類(lèi)型：原代和次代細胞培養，二倍體細胞株和傳代細胞系。

3.病毒分離培養的方法是什么

1）病毒分離培養：用人成纖維細胞分離培養，但通常需要3~14天方可觀(guān)察到CPE，一般需觀(guān)察28天，病變組織標本涂片的常規HE染色，也可直接觀(guān)察CPE和核內嗜堿性包含體。

2）抗原檢測：應用特異性抗體作免疫熒光，直接檢測白細胞、活檢組織、組織切片、支氣管肺泡洗液等臨床標本中的CMV抗原。3）病毒核酸檢測：應用PCR與核酸雜交等方法，可快速、敏感地檢測CMV特異性的DNA片段。

4）抗體檢測：特異性IgG類(lèi)抗體需測雙份血清以作臨床診斷，同時(shí)了解人群感染狀況；IgM抗體只需檢測單份血清以確定活動(dòng)性CMV感染。

4.病毒的培養方法有哪些

病毒的培養方法有動(dòng)物接種、雞胚培養、組織培養、細胞培養。

1、動(dòng)物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進(jìn)入易感動(dòng)物的體內后可大量增殖，并使動(dòng)物產(chǎn)生特定的反應。優(yōu)點(diǎn)：操作方面易行。

缺點(diǎn)：受機體免疫力的影響，常需要用無(wú)菌動(dòng)物。疫苗和抗血清的生產(chǎn)。

2、雞胚培養：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內，羊膜腔，尿囊腔等部位。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。

3、組織培養：在離體活細胞上培養病毒的方法，組織塊培養：取組織片進(jìn)行培養。細胞培養：病毒感染細胞后，大多數引起細胞病變，稱(chēng)為病毒的致細胞病變作用。

表現為細胞變形，胞漿內出現顆粒化，核濃縮、核裂解等。4、采用該病毒所寄生的細胞的全素培養基來(lái)培養該細胞，培養一段時(shí)間后放進(jìn)特定的病毒就可以培養了，注意，若細胞是動(dòng)物細胞時(shí)培養基要加入血清。

5.病毒的提取,培養,及其觀(guān)察的方法

一）、莖尖脫毒 1、莖尖脫毒的依據。

病毒在植物體內分布是不均一的，越接近生長(cháng)點(diǎn)約（0.1-1mm區域），病毒濃度越稀，因此有可能采用小的莖尖離體培養而脫除植物病毒。 2、莖尖培養法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵 （1）、被脫毒植物攜帶病毒的診斷及其在體內的分布 再脫毒之前，應了解植物攜帶何種病毒，病毒在體內的分布位置，以確定培養莖尖的大小 （2）、母體植株的選擇和預處理 母體的選擇： 欲脫毒材料的品種典型性：關(guān)系到脫毒以后的脫毒苗是否保持原品種的特征特性 植體健康程度選擇：應選感病輕、帶毒量少的健康植株作為脫毒的外植體材料，這樣更容易獲得脫毒株。

外植體預處理： （3）、莖尖的剝離 在剝取莖尖時(shí)，把莖芽置于解剖鏡下（8~40倍），一只手用鑷子將其按住，另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進(jìn)行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸入無(wú)菌水進(jìn)行冷卻。

當一個(gè)閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)之后，用解剖刀片將分生組織切下來(lái)，為了提高成活率，可帶1-2枚幼葉，然后將其接到培養基上。接種時(shí)確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。

剝離莖尖時(shí)，應盡快接種，莖尖暴露的時(shí)間應當越短越好，以防莖尖變干。可在一個(gè)襯有無(wú)菌濕濾紙的培養皿內進(jìn)行操作，有助于防止莖尖變干。

將接種好的莖尖置于25℃左右的溫度下。每天以16小時(shí) 2000-3000lx的光照條件下培養。

由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證。微莖尖需數月才能成功。

繼代培養得到足夠的檢測苗、進(jìn)行病毒檢測。 （4）、脫毒效果檢測 A 指示植物鑒定（indicator test plants） 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專(zhuān)化性癥狀的寄主植物。

每種病毒都有自己敏感的植物，例如： 馬鈴薯病毒的敏感植物有千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼佗羅 大麗花病毒的敏感植物為：矮牽牛、黃瓜、莧色蘺 菊花病毒：矮牽牛、豇豆 指示植物鑒定病毒的方法 a.摩擦接種法： 取培養植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），磨成勻獎，將其涂抹在指示植株葉片上，在指示植物的葉片撒上金剛砂，通過(guò)輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片。5分鐘后用清水清洗葉面。

將指示植株放于防蚜蟲(chóng)網(wǎng)罩的溫室內。然后視其病斑的有無(wú)，來(lái)判斷是否脫除了病毒。

例如：植物液接種后如使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內具有馬鈴薯X病毒 b、嫁接法 有些病毒不是通過(guò)汁液傳播，而是通過(guò)專(zhuān)門(mén)的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過(guò)一種特殊的蚜蟲(chóng)為介體進(jìn)行傳播的。這種病毒的鑒定，需將培養植株的芽嫁接在敏感植物上，根據敏感植株的病癥來(lái)判斷是否脫除了病毒 B 血清鑒定（serologic test） 試管沉淀反應；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。

a、試管沉淀反應 在抗原-抗體最適比例的條件下，觀(guān)察有無(wú)沉淀的產(chǎn)生來(lái)確定被測植株是否帶病毒。試管沉淀反應操作簡(jiǎn)單，需注意的問(wèn)題： ①、葉綠體的自發(fā)凝聚 可用磷酸緩沖液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，pH 保持在6.5-8.5） ② 、抗原抗體的比例要適當，當抗原過(guò)量時(shí)回抑制沉淀的形成 b、免疫雙擴散 在半固體凝膠中測定在其中擴散的抗原和抗體間的沉淀反應的方法。

與沉淀法比較起來(lái)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是節約血清，二是汁液不用特殊處理。 步驟： ①倒膠，一般厚2mm ②打孔，多打成梅花型 ③加樣，加血清和汁液。

一般加樣后在37℃恒溫過(guò)夜，即可進(jìn)行結果觀(guān)察。有擴散沉淀的即為帶毒株，沒(méi)有則為不帶毒株 c、酶連免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 它是將抗原、抗體的免役反應和酶的高效催化反應有機結合起來(lái)的一種綜合性技術(shù)。

即通過(guò)化學(xué)的方法將酶與抗體或抗原結合起來(lái)，形成酶標記物。然后將它與相應的抗原或抗體起反應，形成酶標記的免疫復合物。

結合在免疫復合物的酶，在遇到相應的底物時(shí)，催化無(wú)色底物生成有色底物，通過(guò)比色計可以準確測定。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，測定快速，每次可以同時(shí)測定多個(gè)樣品。

C 電鏡檢查法 采用電子顯微鏡，可直接觀(guān)察樣品材料有無(wú)病毒存在，還可以進(jìn)一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結構，這些特征相當穩定，因此電鏡檢查法即準確又有效，但需要有一定的設備和技術(shù)。 D 分子檢測法 例如RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation)將待測的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進(jìn)行反應，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設計引物進(jìn)行PCR反應，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達 n 脫毒苗的離體保存與繁殖：一般是在實(shí)驗室進(jìn)行，一般每月繼代一次，可以在培養基中加入生長(cháng)延緩劑，如B9和矮壯劑可2-3個(gè)月繼代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存 n 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò )體系：如果試管苗生產(chǎn)成本過(guò)高或移栽困難，可將試管苗選擇種植在一定的控制區域，從繁殖技術(shù)和環(huán)境隔離上保證較高水平，使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染 （5） 影響脫毒效果的因素 n 母體材料病毒侵染的程度：?jiǎn)我徊《尽?/p>