mrna提取(RNA提取分離純化時(shí)應(yīng)注意什么?)
1.RNA提取分離純化時(shí)應(yīng)注意什么?
真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5'端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3'端的Poly(A)尾巴。
絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞mRNA的3'端存在20-30個(gè)腺苷酸組成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3'末端含有Poly(A+)的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過(guò)兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA 一、試劑準(zhǔn)備 1.3M醋酸鈉（pH 5.2） 2.0.1M NaOH 3.1*上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時(shí)，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4.洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.無(wú)水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步驟 1.將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。 2.用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3.使用1*上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4.將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2*上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。
當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1*上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。 5.將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。
6.用5-10倍柱床體積的1*上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測(cè)定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無(wú)Poly(A)尾的RNA。
后部分收集管中流出液的OD260值很低或無(wú)吸收。 7.用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8.OD260測(cè)定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc(pH5.2)、2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9.4℃離心，10000g*15min，小心吸棄上清。
用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時(shí)Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。
4℃離心，10000g*5min，棄上清，室溫晾干。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項(xiàng) 1.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須防止Rnase的污染。 2.步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。
所以此步驟不能省略。 3.十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。
5.一般而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。
2.mRNA提取
一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。
二、設(shè)備 研缽，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測(cè)儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 1、無(wú)RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時(shí)）裝蒸餾水，然后加入0。
01%的DEPC（體積/體積），處理過(guò)夜后高壓滅菌。 2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。
3、1*層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7。 6),0。
5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8。0),0。
1% SDS。 4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl (pH7。
6),1mmol/L EDTA (pH8。0),0。
05% SDS。 四、操作步驟 （一）動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0。
2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0。
5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。
RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 （二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，當(dāng)總RNA流徑oligo(dT)纖維素時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。
1、用0。1mol/L NaOH懸浮0。
5-1。0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0。5-1。
0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8。
0。 4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。
5、測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 6、測(cè)定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。
7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5。 2), 2。
5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30分鐘。 8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。
9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0。
3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0。 02%疊氮鈉（NaN3）冰箱保存，重復(fù)使用。
每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 。
3.請(qǐng)教：提取RNA 和反轉(zhuǎn)錄的操作注意事項(xiàng)
你按照買(mǎi)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)做就行.
(1)、從細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA
用GIBCO公司的Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA.按試劑使用說(shuō)明操作：離心收集細(xì)胞，傾去細(xì)胞液，向沉淀中加1 ml Trizo1（每106-107細(xì)胞），混勻至室溫5分鐘，用1 ml加樣器反復(fù)吹打，直至細(xì)胞完全裂解成均一溶液，不粘稠時(shí)為止.隨后加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒鐘，室溫放置5分鐘，然后，4 0C ,12000rpm離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至一Eppendorf管中，加入500ul異丙醇后混勻.4 0C , 1 5000rpm離心15分鐘，傾出異丙醇.用70%乙醇洗滌沉淀一次，置冰上，讓殘余乙醇揮發(fā)殆盡.溶于適量的DEPC水中，紫外分光儀測(cè)定RNA的純度及含量，分裝凍存于一700C保存.
(2)、反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈（參照產(chǎn)品說(shuō)明）
在20ul體系中，加入1ug總RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水，70 0C溫育10分鐘后立即冰浴冷卻，繼續(xù)加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/種)，混勻后于42℃保溫2分鐘，加入1ul( 200U)的反轉(zhuǎn)錄酶，42℃繼續(xù)溫育50分鐘.700C 15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶.
(3)、引物設(shè)計(jì)
(4)過(guò)程： 以1ulcDNA為模板，在50ul體系中含有Taq酶為2單位，dNTPs濃度為200uM，引物各為0.2uM.擴(kuò)增22個(gè)循環(huán).取8ul電泳.
