細胞檢測的方法(檢測細胞增殖的方法)
1.檢測細胞增殖的方法有哪些
一、MTT比色：
MTT比色是一種目前被廣泛采用的檢測細胞生長和存活的方法，其原理是外源性MTT（四唑鹽）可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶的藍紫色結(jié)晶物并沉淀在細胞中，而死細胞無此功能，DMSO（二甲基亞砜）能溶解細胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長處檢測其光密度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)成正比，此方法已廣泛用于檢測細胞活力、觀察細胞生長等方面，具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、經(jīng)濟、快速、易自動化、無放射性污染等特點，與細胞計數(shù)有良好的相關(guān)性。
二、rdU標記法
1.細胞以1.5*105/ml細胞數(shù)接種于直徑35ml培養(yǎng)皿中（內(nèi)放置一蓋玻片），培養(yǎng)1天，用含0.4% FCS培養(yǎng)液同步化3天，使絕大多數(shù)細胞處于G0期。
2.終止細胞培養(yǎng)前，加入BrdU（終濃度為30μg/L）,37℃，孵育40min。
3.棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3%H2O2-甲醇30min滅活內(nèi)源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲酰胺100℃，5min變性核酸。
8.冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1:50），陰性對照加PBS或血清。
9.按ABC法進行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機計數(shù)10個高倍視野中細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)，計算標記指數(shù)（LI）。
三、結(jié)晶紫法
1.體外細胞培養(yǎng)結(jié)束后，去培養(yǎng)液，加入11%的戊二醛固定，置于振蕩器上搖20min。
2.固定細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗凈。
3.置空氣或烘箱37℃徹底干燥。
4.加入0.1%的結(jié)晶紫液對細胞染色，振搖30min。
5.用蒸餾水洗滌，至多余的結(jié)晶紫液沖洗干凈。
6.置空氣或37℃烘箱中徹底干燥。
7.加入10%的乙酸對細胞吸收的結(jié)晶紫進行提取。
8.1h后在酶標儀上測定光吸收度，波長595nm。
四、酸性磷酸酶法
1.96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，去培養(yǎng)液。用0.01mol/L PBS洗滌1次（如為懸浮細胞則用離心洗滌）。
2.去洗滌液后加入磷酸酶底物100μl/孔。
3.37℃，孵育1~4h。
4.加入0.1mol/L氫氧化鈉10μl/孔。
5.在多孔酶標儀上405nm處測光吸收度，將細胞培養(yǎng)板其中不含細胞，同樣處理過的一孔作為空白對照，所測的每孔光吸收度可間接反應(yīng)每孔中的細胞數(shù)。如在同樣條件下作一細胞數(shù)的系列標準對照，以細胞數(shù)為X軸，光吸收度為Y軸，可作直線回歸，可推算出每孔中的細胞。
2.細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法
細胞免疫（CMⅠ）是由多種細胞相互作用的結(jié)果。
免疫細胞間相互作用導(dǎo)致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數(shù)量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復(fù)雜，且很難標準化。
一、遲發(fā)型過敏反應(yīng)的體外檢測方法皮膚試驗和接觸性過敏的誘發(fā)是檢測遲發(fā)型過敏反應(yīng)（DTH）的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發(fā)對曾經(jīng)使病人致敏的抗原的再次應(yīng)答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質(zhì)發(fā)生致敏的能力。
1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結(jié)核菌純蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗時在前臂皮內(nèi)注射少量可溶性抗原，24~48小后，測量紅腫硬結(jié)的大小，硬結(jié)直徑大于10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無反應(yīng)，可用更高濃度的抗原重復(fù)試驗，若仍無反應(yīng)即為陰性，需排除皮試技術(shù)誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由于細胞免疫功能缺損，或由于細胞免疫功能缺損，或由于嚴重感染（麻疹、慢性播散性結(jié)核）造成的無反應(yīng)性。
2.接觸性過敏常應(yīng)用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質(zhì)結(jié)合而導(dǎo)至DTH反應(yīng)。
在動物試驗時，初次皮膚上涂抹DNCB后間隔7~10天再激發(fā)刺激，則皮膚出現(xiàn)即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法體外檢測淋巴細胞的數(shù)量和功能，最易采集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊于淋巴細胞分層液之上離心時，由于紅細胞（1.092）、多形核白細胞（1.090）、淋巴細胞（1.070）的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。
仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞占80%，單核細胞占20%，淋巴細胞中T細胞占80%,B細胞占4%~10%，其作為非DT、非B細胞。1.T細胞計數(shù)（1）E花環(huán)法：人類T細胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，將經(jīng)分層液分離現(xiàn)的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經(jīng)37℃培養(yǎng)5~10分鐘放4℃過夜，取細胞懸計數(shù)，外周血淋巴細胞中約70%~80%淋巴細胞結(jié)成花環(huán)即為T細胞。
目前此方法已用來分離T細胞，而不用做T細胞計數(shù)。（2）用單克隆抗體計數(shù)T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結(jié)合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結(jié)果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3 細胞即總T細胞。
正常人在PBM中T細胞占70%~80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應(yīng)與CD3 細胞數(shù)一致。
CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小于1.7。2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質(zhì)稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化。
T細胞轉(zhuǎn)化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最圖導(dǎo)致細胞分裂。在光學(xué)顯微鏡下可計數(shù)轉(zhuǎn)化后的淋巴細胞數(shù)，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。
最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應(yīng)的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色甲（fromazan）產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細胞數(shù)正相關(guān)。
結(jié)果可用酶標檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結(jié)果與3H-TdR摻入法平行，并能反應(yīng)試驗中的活細胞數(shù)。
3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細胞毒效應(yīng)的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，于37℃培養(yǎng)1小時左右，51Cr即可進入靶細胞，與胞漿蛋白結(jié)合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50:1或100:1）靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。
用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。細胞毒試驗檢測Tc細胞效應(yīng)功能是否健全，及經(jīng)IgG介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4.混合淋巴細胞的反應(yīng)（MIR） 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養(yǎng)4~5天，在最后8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應(yīng)性。
或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合（靶細胞來自與刺激細胞相同的個體）如果T細胞受刺激后產(chǎn)生了細胞毒T細胞，可殺死活的細胞，根據(jù)靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子）和LIF（白細胞移動抑制因子）來評估細胞免疫功能。近年來應(yīng)用測定IL-2的免疫酶技術(shù)，操作簡單，并能定量以取代了MIF和LIF的測定。
單個核細胞與分裂原。
3.檢測細胞凋亡的方法有哪些
一、形態(tài)學(xué)觀察方法 1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊狀，細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。
此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。 4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳 （一）檢測原理 細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180-200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區(qū)別。
（二）結(jié)果判斷 正?；罴毎鸇NA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。 三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定 凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。
核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。 （一）檢測步驟 1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體； 2、在微定量板上吸附組蛋白體； 3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合； 4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合； 5、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途 該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞?？捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。
該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。 四、流式細胞儀分析 （一）檢測原理 細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。
利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。 （二）應(yīng)用價值 流式細胞儀檢測具有以下特點： 1）、檢測的細胞數(shù)量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確 2）、可以做許多相關(guān)性分析 3）、結(jié)合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期 ■檢測形態(tài)學(xué)及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法 細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。 ■DNA片斷原位標記法 凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術(shù)是指在細胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,DUTP）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）相反應(yīng)與凋亡細胞裂解后3.的羥基（-OH）端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測DNA裂解點的技術(shù)。
DNA片段原位標記法有二種： 1、原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation,ISNT）技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3-OH端 2、原位缺口末端標記技術(shù)（in situ end labelling technique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL為合適。
■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法 1、原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)是鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。
因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結(jié)果判斷：正?；罴毎鸄nnexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。 3、應(yīng)用價值：細胞發(fā)生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。
又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時，結(jié)果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
4.細胞活力測定的方法有哪些
根據(jù)每個細胞有一定的重量而設(shè)計的。
它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。
不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器內(nèi)冷卻，再稱量，求出微生物干重。如果要測定固體培養(yǎng)基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。
除了干重、濕重反映細胞物質(zhì)重量外，還可以通過測定細胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細胞的主要成分，含量也比較穩(wěn)定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。
從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌后，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%，細菌中蛋白質(zhì)含量占細菌固形物的50%一80%，一般以65%為代表，有些細菌則只占13%一14%，這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的。
因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算：蛋白質(zhì)總量=含氮量*6.25核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個細菌的DNA含量相當恒定，平均為8.4*`10^(-5)`NG。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數(shù)。
5.免疫學(xué)的檢測方法有哪些
免疫學(xué)檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。
體液免疫：
所謂體液免疫，即以B細胞產(chǎn)生抗體來達到保護目的的免疫機制。負責體液免疫的細胞是B細胞。體液免疫的抗原多為相對分子質(zhì)量在10,000以上的蛋白質(zhì)和多糖大分子，病毒顆粒和細菌表面都帶有不同的抗原，所以都能引起體液免疫。
臨床上一個反復(fù)發(fā)作的化膿感染，常使醫(yī)生想到患者是否有免疫缺陷病，一般原發(fā)免疫缺陷發(fā)病年齡很小，而繼發(fā)免疫缺陷病人多在30歲以上。絕大多數(shù)免疫缺陷病人多表現(xiàn)為體液和細胞免疫同時受損，所以應(yīng)全面檢查這兩方面的功能。遺憾的是，目前應(yīng)用的檢測方法的局限性，其結(jié)果常難以得出明確結(jié)論。
細胞免疫：
T細胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細胞（也叫效應(yīng)T細胞），當相同抗原再次進入機體的細胞中時，致敏T細胞（效應(yīng)T細胞）對抗原的直接殺傷作用及致敏T細胞所釋放的細胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱為細胞免疫。
在抗感染免疫中，細胞免疫主要參與對胞內(nèi)寄生的病原微生物的免疫應(yīng)答及對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，參與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病的形成，參與移植排斥反應(yīng)及對體液免疫的調(diào)節(jié)。也可以說，在抗感染免疫中，細胞免疫既是抗感染免疫的主要力量，參與免疫防護；又是導(dǎo)致免疫病理的重要因素。
6.細胞凋亡常用的檢測方法有哪些
1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
(1) 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
(2) 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
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7.細胞活性檢測的方法有多少種
細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克?。洌┬纬煞ā?H 放射性同位素摻入法、MTT 法等。
其中 MTT 法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但 MTT 法形成的 Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的 Formazan ，故有時重復(fù)性略差。
為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如 XTT 、CCK-8 ( WST-8 )等。
